SSR：サイト特異的組換え

SSR：サイト特異的組み換え

部位特異的組換え技術は、組換え酵素（Cre、FLP）を利用して特定のDNA配列を置換する遺伝子工学の手法である。

これらは30～50塩基対（lox、FRT）のDNA配列を正確に認識し、それらを結合させ、DNAを切断・交換・再結合させて新たな構成を作り出す。その結果、通常、遺伝子の挿入、欠失、または反転が生じる。

この技術は、突然変異を発達過程の特定の時点や特定の細胞タイプに限定する必要がある場合（コンディショナル ）に、特に威力を発揮します。

現在、細胞株やげっ歯類の遺伝子工学において最も一般的に使用されているシステムは、 Cre-loxシステムとFLP-FRTシステムである。

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仕組みはどのようなものですか？

組換え酵素タンパク質（Cre、FLP）は、2つのDNA部位（lox、FRT）を認識して結合し、それらを近づけて複合体を形成します。DNAの切断と組換えは、この複合体の中で行われます。

2つの部位が同じ分子上にある場合、その結果は、2つの部位の向きが同じか反対かによって、それぞれ切除または反転のいずれかとなります。

挿入は、認識部位が2つの異なるDNA分子上にあり、そのうち1つが環状である場合に発生する。

SSRに基づくゲノム改変戦略

コンディショナル （例えば、組織特異性）や選択マーカーの切除を目的としたCre-loxPおよびFLP-FRTシステムの体系的な利用に加え、さらに詳しく取り上げる価値のある3つの成功した遺伝学的戦略がある：

Cre-ERt2

Cre活性の時間的制御により、胚発生のより後期段階や成体動物において遺伝子改変を誘導することが可能となる。これにより、胚致死性といった潜在的な欠点を回避できる。

時間依存的なCre活性を特異的に誘導するため、リコンビナーゼはヒトエストロゲン受容体（ER）のリガンド結合ドメインの変異型（ERt2）と融合されている。エストロゲン受容体拮抗薬であるタモキシフェンはCre-ERt2に結合し、この複合体が細胞核内に取り込まれることを可能にする。そこでCreが部位特異的な遺伝子改変を誘導する。

タモキシフェンが存在しない場合、Cre-ERt2融合タンパク質は厳密に細胞質内に留まる。

FLEx

この戦略は、空間的に突然変異を誘導する洗練された手法であり、野生型遺伝子の内因性プロモーターの制御下で点突然変異を誘導するための代表的な技術である。

サイト特異的組換え酵素（CreまたはFLP）は、対象となるDNA配列を反転させ、それによって活性化させることで、遺伝子改変を誘導する。

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RMCE

リコンビナーゼを介したカセット交換（RMCE）は、大規模なゲノム配列を挿入するための最適な手法である。また、この手法を用いることで、同一の親胚性幹細胞クローンから複数の変異体を生成し、比較研究を行うことも可能となる。

野生型遺伝子は、2つの異なる特異的認識部位に挟まれている。対象となる遺伝子の変異型を、同じ2つの異なる特異的認識部位に挟まれた状態で保持するDNAプラスミドが存在する場合、Creのようなリコンビナーゼが、野生型遺伝子と変異型遺伝子を交換・置換することができる。

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