IRES : site d'entrée interne dans le ribosome

Création de modèles de co-expression et/ou de modèles rapporteurs

L'IRES (site d'entrée interne dans le ribosome) permet au chercheur de co-exprimer plusieurs gènes sous le contrôle d'un même promoteur. Au cours de la dernière décennie, l'IRES a été utilisé pour développer des centaines de modèles génétiquement modifiés, et il est considéré comme la technologie de référence pour la co-expression de transgènes dans les modèles animaux de rongeurs.

Comment ça marche ?

Le promoteur endogène du gène cible régule la transcription d'un seul ARNm contenant les régions codantes du gène d'intérêt (voir figure ci-dessous, en bleu) et du gène rapporteur fluorescent (voir figure ci-dessous, en rouge). Le gène rapporteur et le gène d'intérêt sont exprimés sous forme de deux protéines indépendantes (non fusionnées), ce qui permet en fin de compte à la protéine rapporteuse de rester pleinement fonctionnelle. L'expression endogène du gène d'intérêt est préservée autant que possible.

Applications de la technologie IRES

1) Création de modèles de maladies à base de gènes multiples

La technologie IRES a été utilisée avec succès pour créer des modèles reproduisant diverses pathologies humaines. Plusieurs ADNc peuvent être exprimés sous le contrôle d'un même promoteur. Il en résulte la co-expression de ces gènes dans les mêmes cellules ou tissus.

Étude de cas : modèle murin avancé de la maladie d'Alzheimer

Ryan D, Koss D, Porcu E, Woodcock H, Robinson L, Platt B, Riedel G.
Les troubles de l'apprentissage spatial chez les souris PLB1Triple knock-in atteintes de la maladie d'Alzheimer sont spécifiques à la tâche et dépendent de l'âge.
Cell Mol Life Sci. 2013.

Platt B, Drever B, Koss D, Stoppelkamp S, Jyoti A, Plano A, Utan A, Merrick G, Ryan D, Melis V, Wan H, Mingarelli M, Porcu E, Scrocchi L, Welch A, Riedel G.
Anomalies cognitives, du sommeil, de l’EEG et du métabolisme cérébral chez une nouvelle souris knock-in modélisant la maladie d’Alzheimer, PLB1.
PlosOne 2011.

Conception de la construction génétique du gène PLB1 et niveaux d'expression

A) Séquence génomique de la construction transgénique comprenant le promoteur CaMKIIα, la protéine APP humaine (hAPP), un site d'entrée ribosomique interne (IRES), suivi de la protéine Tau (hTau) ; les sites de mutation sont également indiqués. Les séquences hAPP et hTau étaient flanquées respectivement de sites loxP et FRT. Neo : cassette de sélection à la néomycine.

B) L'expression de l'ARNm des transgènes hAPP (à gauche) et hTau (à droite), mesurée dans le cortex, est restée stable dans le temps ; les animaux homozygotes (homo) présentaient des niveaux d'expression 2 à 3 fois supérieurs à ceux des souris hétérozygotes (het).

2) Création de modèles rapporteurs

L'IRES peut être utilisé pour insérer un gène rapporteur dans la région 3' UTR du gène d'intérêt. Une fois activé, l'ARNm composant la construction IRES-gène rapporteur-gène cible est traduit en deux protéines indépendantes.

Ce marqueur permet au chercheur de quantifier le niveau d’expression d’un gène, de suivre les cellules exprimant le gène d’intérêt et de surveiller la régulation de ce gène. Historiquement, de tels modèles ont été générés, par exemple, pour quantifier la fonction effectrice des lymphocytes T régulateurs (voir le cas n° 1 ci-dessous), pour quantifier la production de cytokines, pour suivre dans le temps les cellules productrices de cytokines et pour visualiser un récepteur olfactif particulier dans les neurones olfactifs (voir le cas n° 2 ci-dessous).

Études de cas : les gènes rapporteurs luciférase et mRFP

Cas n° 1 | Modèle IRES-luciférase pour la surveillance in vivo des cellules souches hématopoïétiques et des précurseurs érythrocytaires à division rapide

Alvarez S, Díaz M, Flach J, Rodriguez-Acebes S, López-Contreras AJ, Martínez D, Cañamero M, Fernández-Capetillo O, Isern J, Passegué E, Méndez J.
Le stress de réplication provoqué par une faible expression de MCM limite l'érythropoïèse fœtale et la fonctionnalité des cellules souches hématopoïétiques.
Nat Commun. 2015.

Souche de souris porteuse d'un allèle hypomorphe du gène Mcm3.

A) Un allèle Mcm3 de souris modifié a été conçu avec des sites loxP flanquant les exons 14 à 17 et un gène rapporteur luciférase inséré dans la région 3' UTR sous le contrôle d'un élément IRES. L'allèle ainsi obtenu (Mcm3-lox) était destiné à servir de KO conditionnel, l'expression de Mcm3 pouvant être supprimée à l'aide de la recombinase Cre.

B) L'expression de Mcm3-lox pouvait être suivie grâce à l'activité bioluminescente liée à l'expression de la luciférase.

Cas n° 2 | Modèle murin rapporteur Foxp3-IRES-mRFP (FIR) permettant de suivre l'activité des lymphocytes T régulateurs

Dioszeghy V, Mondoulet L, Dhelft V, Ligouis M, Puteaux E, Dupont C, Benhamou PH.
L'induction de cellules T régulatrices par l'immunothérapie épicutanée est durable et assure une protection à long terme contre les troubles éosinophiles chez les souris sensibilisées à l'arachide.
Clin Exp Allergy. 2014.

Wan YY, Flavell RA.
Identification des lymphocytes T suppresseurs exprimant Foxp3 à l'aide d'un rapporteur bicistronique.
Proc Natl Acad Sci USA. 2005.

Figure 1. Intégration du rapporteur IRES-mRFP dans le locus Foxp3 de la souris.

A) Cartes du locus Foxp3 de la souris, de la construction d'ADN ciblée et du locus Foxp3 ciblé. Un fragment d’ADN génomique de souris de 11 kb, comprenant l’exon 13 du gène Foxp3, a été excisé à l’aide des enzymes BstZ17I (B) et HpaI (H) (figure 1, en haut) puis cloné dans le vecteur pEasy-Flox à proximité du marqueur de sélection thymidine kinase (TK). Une cassette contenant l’IRES-mRFP et le marqueur de sélection néomycine (Neo) flanqué de loxP a été insérée dans un site SspI (S) situé entre le codon d’arrêt de traduction (UGA) et le signal de polyadénylation (_A2UA3) du gène Foxp3 (au milieu). Une cellule ES correctement ciblée a été utilisée pour créer des chimères et des souris à transmission germinale. Le gène Neo a été supprimé in vivo à l’aide de souris déleteuses transgéniques pour la recombinase Cre afin de générer des souris portant le locus Foxp3 ciblé (en bas).

B) Génotypage par PCR des souris FIR. Trois amorces (P1 à P3, comme indiqué) ont été conçues pour le génotypage des souris FIR. La PCR a donné un produit de 517 pb pour l’allèle Foxp3 de type sauvage (wt) et un produit de 470 pb pour l’allèle Foxp3 ciblé.

Figure 2. L'expression de mRFP permet de marquer fidèlement les lymphocytes T CD4 exprimant Foxp3 sans compromettre leur activité régulatrice, et l'expression de Foxp3 a été détectée dans différents compartiments lymphocytaires.

Des lymphocytes périphériques provenant de souris FIR ont été prélevés et marqués à l'aide d'anticorps anti-CD4 et anti-CD25 conjugués à un fluorophore. L'expression de la mRFP dans les lymphocytes T CD4 a été évaluée par cytométrie en flux (à gauche). L'ARN a été extrait de différentes populations de lymphocytes T CD4 périphériques (comme indiqué), purifiées à partir de souris FIR par FACS. Les niveaux relatifs d'ARNm de Foxp3 ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel TaqMan, et les résultats combinés de deux expériences ont été représentés graphiquement.

3) Création de modèles de suivi des lignées cellulaires

L'insertion d'un IRES dans la région 3' UTR du gène d'intérêt nous permet de développer des modèles de suivi des lignées cellulaires. Les chercheurs peuvent utiliser ces modèles pour étudier et analyser le devenir cellulaire spatio-temporel de populations cellulaires données.

Étude de cas : expériences de traçage de la lignée de l'épithélium intestinal

Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, Haegebarth A, Korving J, Begthel H, Peters PJ, Clevers H.
Identification de cellules souches dans l'intestin grêle et le côlon à l'aide du gène marqueur Lgr5.
Nature. 2007.

Figure 1. Génération de souris exprimant l'EGFP et le Cre-ERt2 à partir d'un seul message bicistronique par insertion d'un gène dans le premier exon du gène Lgr5.

Figure 2. Suivi de la lignée cellulaire dans l'intestin grêle et le côlon.

A) Souris « knock-in » Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 croisée avec des souris rapporteuses Rosa26-lacZ 12 heures après l'injection de TAM.

B) Fréquence d'apparition des cellules bleues à des positions spécifiques par rapport au fond de la crypte, selon le schéma présenté dans l'encart. La plupart des cellules cylindriques de la base de la crypte (CBC) marquées par Cre1 LacZ se trouvaient entre les cellules de Paneth, tandis que seulement 10 % de ces cellules ont été observées à la position « 14 », directement au-dessus desdites cellules (ligne bleue). Des données quantitatives sur la position des cellules conservant à long terme le marqueur ADN, obtenues chez des souris adultes après irradiation (marquant la « 14 », cellule souche intestinale), ont été publiées récemment (Potten et al., J. Cell Sci., 2002). Le graphique présente une comparaison de ces données (ligne rouge) avec la position des cellules CBC porteuses de Cre activé.

C-E) Analyse histologique de l'activité de la LacZ dans l'intestin grêle un jour après l'induction (C), cinq jours après l'induction (D) et 60 jours après l'induction (E).

F-H) Le double marquage de l'intestin coloré au LacZ à l'aide de la technique PAS (acide périodique-Schiff) met en évidence la présence de cellules caliciformes (F, flèches blanches) et de cellules de Paneth (G, flèches bleues) dans les clones bleus induits. Le double marquage à la synaptophysine met en évidence la présence de cellules entéroendocrines au sein des clones bleus induits (H, flèches noires).

I-K) Analyse histologique de l'activité de LacZ dans le côlon un jour après l'induction (I), cinq jours après l'induction (J) et 60 jours après l'induction (K).

4) Suivi des profils d'expression cellulaire dans les modèles KO

Les systèmes IRES sont largement utilisés dans les modèles de souris « knock-out » conditionnels développés par des consortiums de knock-out à haut débit tels que KOMP, EUCOMM et NorCOMM.

Ces systèmes permettent au chercheur d'étudier les profils d'expression génique et la régulation des gènes dans divers tissus et cellules.

Modèles « knock-out » prêts à l'emploi pour des études in vivo

genOway donne accès à plus de 10 000 modèles murins prêts à l'emploi issus d'EUCOMM. Parmi ceux-ci, 1 200 lignées phénotypées ont été mises en correspondance avec des maladies humaines liées à l'immunologie et à l'inflammation, à l'immuno-oncologie, au métabolisme, aux neurosciences, à la douleur, ainsi qu'aux maladies cardiovasculaires et musculo-squelettiques.

Vérifiez si votre gène préféré figure parmi les modèles disponibles sur genOway.

Exemple de carte vectorielle EUCOMM :

5) Création de lignées porteuses du gène Cre spécifiques à certains tissus

L'IRES est souvent utilisé pour la génération de lignées porteuses du gène Cre de type « knock-in ». L'approche « knock-in » permet à la lignée porteuse de refléter fidèlement le profil d'expression du locus d'expression Cre sélectionné.

La séquence IRES permet de maintenir l'expression du gène cible ou de permettre la co-expression d'un gène rapporteur. Le gène rapporteur peut fournir des informations sur le niveau d'expression ou sur le profil d'expression de la recombinase Cre.

Études de cas : recombinaison ciblée dans les neurones et ciblage sélectif avec HDC-Cre

Cas n° 1 | Mise en évidence d'une recombinaison ciblée dans les neurones exprimant la PrRP

Dodd GT, Worth AA, Nunn N, Korpal AK, Bechtold DA, Allison MB, Myers MG Jr, Statnick MA, Luckman SM.
L'effet thermogénique de la leptine dépend d'une population distincte de neurones sécrétant le peptide libérateur de prolactine dans l'hypothalamus dorsomédial.
Cell Metab. 2014.

La recombinase Cre est exprimée exclusivement dans les neurones PrRP

Immunomarquage double pour la PrRP (bleu) et l'eGFP (rouge), ainsi que la fluorescence endogène de l'eGFP (vert), dans le noyau hypothalamique dorsomédial (DMH), le noyau du tractus solitaire (NTS) et le bulbe rachidien ventrolatéral (VLM) de souris PrRP-cre::eGFP.

Cas n° 2 | Ciblage génétique sélectif par type cellulaire à l'aide de souris HDC-Cre

Zecharia AY, Yu X, Götz T, Ye Z, Carr DR, Wulff P, Bettler B, Vyssotski AL, Brickley SG, Franks NP, Wisden W.
L'inhibition GABAergique des neurones histaminergiques régule l'état de veille actif, mais pas le passage du sommeil à l'éveil ni la perte de conscience induite par le PPF.
J Neurosci. 2012.

Stratégie de ciblage génétique visant à produire la lignée de souris « knock-in » HDC-Cre.

La cassette IRES-Cre a été placée dans l'exon 12 du gène hdc, entre le codon d'arrêt (TAG) et le signal de polyadénylation (pA). Un gène de résistance à la néomycine flanqué de séquences FRT a été inséré en aval pour permettre une sélection positive dans les cellules ES. Pour la sélection négative, nous avons utilisé un gène exprimant la GFP, qui flanquait le bras d'homologie 3' de la 3' et avons analysé les colonies non fluorescentes. Une fois le ciblage réussi, la cassette de néomycine (Neo) a été éliminée par la recombinase FLP pour obtenir l'allèle ciblé final.