Recombinaison homologue

Technologie de ciblage génique pour les modèles humanisés, « Knock-in » et « Knock-out » conditionnel

La recombinaison homologue est un processus de recombinaison génétique au cours duquel des séquences nucléotidiques sont échangées entre deux molécules d'ADN similaires ou identiques.

Cette technique est couramment utilisée en génétique murine. Également appelée « ciblage génique », cette méthode permet de remplacer spécifiquement une copie d'un gène en y intégrant un gène différent de celui d'origine.

La création de souris « knock-out » à partir de cellules souches embryonnaires, permettant d'introduire du matériel génétique artificiel afin de désactiver le gène cible chez la souris, présente un intérêt thérapeutique.

De plus, cette technologie permet d’introduire de manière fiable et efficace une mutation, un gène rapporteur ou une séquence génétique humaine spécifique dans des loci endogènes, ce qui permet d’obtenir des modèles de maladies humaines plus précis et plus pertinents sur le plan physiologique.

Ces modèles ont un impact significatif sur les expériences de recherche et les programmes de développement de médicaments, couvrant des activités allant de la validation des cibles aux études ADMET.

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Création de modèles murins classiques par recombinaison homologue

Récepteurs membranaires cellulaires humanisés destinés aux essais de composés

Les récepteurs membranaires cellulaires, tels que les GPCR, les récepteurs de cytokines, les récepteurs d’immunoglobulines (FcR), les canaux anioniques activés par un ligand, les canaux sodiques voltage-dépendants, etc., constituent des cibles thérapeutiques importantes. Le remplacement de la protéine de souris par son homologue humain permet d’évaluer l’efficacité et de mener des études d’affinité avec une prévisibilité et une précision accrues.
genOway possède une vaste expérience dans l’humanisation des récepteurs (plus de 100 modèles créés avec succès) afin de garantir que la transcription, la traduction et l’expression soient efficaces et reproduisent fidèlement la situation humaine.
Les modèles murins humanisés pour les récepteurs membranaires ont démontré leur valeur ajoutée dans les programmes de développement de médicaments, et la « technologie d’humanisation et de knock-in » est une technologie clé pour atteindre cet objectif.

Étude de cas : Humanisation du récepteur membranaire CCR2 (également appelé CD192) en vue de l'évaluation in vivo de la spécificité et de l'efficacité de petites molécules.

Adapté de Prosser et al., DDR 2002, « Remplacement ciblé du gène CCR2 des rongeurs par son orthologue humain CCR2B : un modèle murin pour l’analyse in vivo d’antagonistes de la petite molécule du récepteur MCP-1 sélectifs pour la cible humaine ».

Le CCR2 humain est fonctionnel

Le gène CCR2 humain est exprimé et fonctionnel chez les animaux humanisés, où il remplace le gène CCR2 murin inactivé.

Des études d'expression ont été réalisées sur l'ARNm (données non présentées).
Fonctionnalité : une réponse inflammatoire normale est observée suite à une injection intrapéritonéale de thioglycollate (données non présentées).

Le modèle CCR2 humanisé constitue un outil de criblage extrêmement précieux

L'activité d'un antagoniste sélectif du CCR2 humain est mieux prédite et reproduite dans les modèles humanisés du CCR2 que dans les modèles de type sauvage.

La capacité du SB-399721 à inhiber la chimiotaxie des cellules péritonéales de souris « knock-in » CCR2, stimulée par le virus de l'encéphalite japonaise (IC₅₀ = 820 ± 83 nM), était environ 7 fois supérieure à celle observée chez les cellules péritonéales de souris de la même portée de type sauvage (IC₅₀ = 5 500 ± 900 nM).

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Molécules de membrane cellulaire humanisées pour l'évaluation in vivo d'anticorps et de produits biologiques

Le développement exponentiel des anticorps monoclonaux et des produits biologiques a ouvert la voie à des thérapies innovantes. L'évaluation in vivo des anticorps monoclonaux nécessite de nouveaux types de modèles animaux. En raison de leur grande spécificité, les anticorps monoclonaux ne peuvent pas être correctement évalués sur des protéines de souris. L'évaluation ne peut avoir lieu que dans un modèle animal humanisé, où l'anticorps se lie à l'antigène humain. La plupart du temps, il est nécessaire que, après humanisation, la voie de transduction reste fonctionnelle, ce qui implique que l'antigène humain soit capable de se substituer fonctionnellement à son homologue murin. La disponibilité d'un modèle humanisé est devenue une étape incontournable pour l'évaluation des anticorps monoclonaux et des produits biologiques. Fort de son expérience dans le domaine des modèles humanisés (plus de 250 modèles créés avec succès), genOway est reconnu pour son excellence dans le développement de modèles humanisés destinés aux essais de produits biologiques.

Étude de cas : Humanisation du CTLA-4 (antigène des lymphocytes T cytotoxiques) pour l'évaluation in vivo de la spécificité et de l'efficacité des anticorps monoclonaux.

Le CTLA-4, un récepteur à haute affinité pour le CD80 et le CD86, peut inhiber l'activation des lymphocytes T. Il a été démontré que le blocage du CTLA-4 favorise l'immunité antitumorale.

D'après Lute et al., Blood, 2005. Des souris knock-in humaines exprimant le gène CTLA-4 permettent de mettre en évidence le lien quantitatif entre l'immunité antitumorale et l'auto-immunité induite par les anticorps anti-CTLA-4.

Le gène humain CTLA-4 est exprimé

Le gène humain CTLA-4 est exprimé chez les animaux humanisés, en remplacement du gène murin CTLA-4 inactivé.

Des analyses d'expression ont été réalisées par FACS sur des splénocytes CD4 non stimulés.

Le gène humain CTLA-4 est fonctionnel

Les gènes CTLA-4 humains remplacent fonctionnellement les gènes CTLA-4 murins.

Développement normal des organes lymphoïdes chez des souris humanisées exprimant le gène CTLA-4.

Le modèle humanisé CTLA-4 constitue un outil de criblage extrêmement précieux

Discrimination fiable de l'activité thérapeutique entre des anticorps anti-CTLA-4 présentant une affinité et un isotope identiques chez des souris humanisées pour le gène CTLA-4.

Une régression complète des tumeurs a été observée chez 2 souris sur 9, ainsi qu'un ralentissement de la croissance tumorale (données non présentées) dans le groupe traité par l'anticorps 3.

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Molécules solubles humanisées (Ig, protéines de transport, interleukines et hormones)

Les protéines sécrétées constituent des cibles et des biomarqueurs importants pour la recherche biomédicale. L'humanisation de ces molécules solubles fournit des modèles de recherche très précieux, comme par exemple l'humanisation de :

• Gènes d'immunoglobulines pour la production in vivo d'anticorps chimériques et entièrement humains.
• Des protéines de transport telles que l'albumine, afin d'étudier l'impact du transport sanguin sur la demi-vie ou l'activité du composé.
• Interleukines et hormones destinées à des études in vivo sur des NCE ou des anticorps ciblant ces molécules solubles.

Les modèles humanisés peuvent également servir à générer des modèles tolérants à un isotype d'anticorps humain donné et à éviter une réponse immunitaire de la souris contre un anticorps thérapeutique lors des essais sur des souris.

Étude de cas : Création d'un modèle d'IgG1 humanisée pour l'évaluation in vivo de l'efficacité thérapeutique et de la toxicité de l'IgG1 humanisée.

LIGNE DE SOURIS DISPONIBLE CHEZ GENOWAY. POUR PLUS D'INFORMATIONS, VEUILLEZ NOUS CONTACTER.

Les régions constantes des chaînes légères et lourdes des immunoglobulines IgG1 ont été humanisées (encadrés rouges).

Les régions variables proviennent de la souris.

Le modèle d'IgG1 humanisé est pleinement fonctionnel pour le développement et les essais d'anticorps

Lorsqu'elles sont stimulées, les souris humanisées pour l'IgG1 produisent de l'IgG1 humaine et aucune IgG1 murine. L'expression des autres isotypes reste inchangée. Ces souris présentent une tolérance à l'IgG1 humaine.

La réponse humorale a été évaluée par ELISA après stimulation au KLH. Les immunoglobulines IgG1 de souris ne sont pas exprimées. L'IgG1 humaine est détectée à un niveau normal.

Ce modèle permet de produire tous les autres isotopes murins, notamment l'IgM, l'IgD, l'IgG3, l'Ig2a, l'Ig2b, l'IgE et l'IgA (données non présentées).

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Suivi de l'expression des biomarqueurs

Les biomarqueurs sont devenus des outils essentiels pour les études physiologiques. Ils permettent :

• Détection d'un événement précoce dans la cascade de réponses.
• Quantification d'une réponse physiologique.

Des modèles « knock-in » pourraient être conçus afin de fournir des outils précieux pour le suivi de l'expression des biomarqueurs. Dans le cadre de cette approche, un marqueur rapporteur sera exprimé simultanément au biomarqueur. Afin d'éviter toute interférence avec les activités biologiques du biomarqueur, genOway associe sa technologie IRES à la technologie d'humanisation « knock-in » pour obtenir une expression bicistronique, de sorte que l'expression du biomarqueur ne soit pas altérée par celle du marqueur rapporteur.

Il est ainsi possible de surveiller efficacement et facilement l'expression du biomarqueur sans interférer avec son réseau fonctionnel. Cette approche fournit des informations plus fiables et plus utiles dans des conditions physiologiques normales, mais aussi, ce qui est plus intéressant encore, dans des conditions pathologiques, lors de régimes alimentaires particuliers, en situation de stress, etc.

Ces modèles ont été mis au point pour évaluer les composés modulant la réponse immunitaire, détecter une réponse immunitaire protectrice et mettre en évidence les fonctions effectrices (cytotoxiques, antitumorales, cellules auxiliaires, cellules répressives).

Étude de cas : Suivi de l'expression de l'IL-4.

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D'après Mohrs et al., Immunity 2001. Analyse de l'immunité de type 2 in vivo à l'aide d'un rapporteur bicistronique de l'IL-4.

L'IL-4 induit la différenciation des lymphocytes Th naïfs en lymphocytes Th2, orientant ainsi la réponse immunitaire vers une réponse effectrice humorale. L'IL-4 reste le marqueur canonique des lymphocytes Th2.

L'expression du gène rapporteur n'interfère pas avec l'expression de l'IL-4.

Le suivi de l'expression du gène IL4 s'effectue par insertion du gène rapporteur dans la région 3'UTR (expression bicistronique via la technologie IRES). L'expression du gène rapporteur est proportionnelle à celle du gène IL4.

Suivi fiable et sensible de l'expression de l'IL-4

Le rapporteur n'est détecté que dans les cellules exprimant l'IL-4, ce qui permet une détection et un suivi fiables de l'expression de l'IL-4.

L'expression de la GFP est en corrélation avec celle de l'IL-4 et permet de suivre les événements précoces d'une immunité effectrice de type 2. Ce résultat a été établi par analyse FACS sur des splénocytes activés.
Bien que toutes les conditions de culture induisent une division cellulaire (activation), les cellules GFP+ ne sont détectées que dans les conditions de culture favorisant la polarisation Th2. De plus, la GFP peut être détectée dès 36 h après le début de la culture, ainsi qu'avant la division cellulaire (40 à 45 h).

Suivi avec une activité de l'IL-4 non modifiée

La fonction biologique et effectrice de l'IL-4 est préservée chez les souris porteuses du gène rapporteur GFP. L'expression de la GFP permet un suivi fiable des réponses à l'IL-4.

Analyse par FACS de cellules fraîchement isolées provenant de différents organes.

La protection contre Nocardia brasiliensis est médiée par les cellules Th2. Une activation efficace des cellules Th2 entraîne l'expulsion des vers en moins de 10 jours. L'activation des cellules CD4 a été analysée dans les poumons, les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN), les ganglions lymphatiques périphériques (PLN) et les splénocytes. L'apparition de cellules productrices d'IL-4 coïncide avec le déplacement des vers et démontre que la présence de GFP n'altère pas l'immunité protectrice à médiation Th2.

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Suivi des effets hors cible

Les xénobiotiques peuvent moduler, directement ou indirectement, l'expression ou la fonctionnalité des gènes cibles. L'identification et la quantification de ces activités non spécifiques constituent une étape importante dans la plupart des programmes de développement de médicaments, notamment dans le cadre des études ADMET (par exemple, la modulation par les SXR de la famille CYP450 3A).

Les modèles animaux génétiquement modifiés peuvent aider à prévoir et à mesurer les effets non spécifiques :

• L'humanisation de ces gènes cibles dans des modèles animaux permet une détection plus prévisible des activités non spécifiques.
• Des gènes rapporteurs peuvent être insérés dans les loci des gènes des biomarqueurs afin de mesurer l'induction ou la répression de l'expression de ces biomarqueurs.

Étude de cas : les souris humanisées exprimant le récepteur CAR (récepteur constitutif de l'androstane) permettent de mener des études DMPK plus prévisibles que les souris de type sauvage.

D'après Scheer et al., J Clin Invest 2008. Une nouvelle série de modèles murins permettant d'évaluer le rôle du récepteur X des pregnanes humains et du récepteur constitutif de l'androstane dans la réponse aux médicaments.

La CAR intervient dans la régulation transcriptionnelle du métabolisme des médicaments.

Le modèle CAR humanisé constitue un outil plus pertinent pour les études DMPK

Le CITCO est un inducteur de CAR spécifique à une espèce qui active le huCAR chez les souris humanisées.

Cela reproduit une réponse propre à l'être humain dans un environnement murin.

Pharmacocinétique du midazolam et du bupropion chez des souris WT et huCAR traitées par CITCO.

Augmentation de la clairance des médicaments chez les souris humanisées.

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Marquage pour le suivi des cellules

Cette technologie Knockin vise à insérer un gène rapporteur dans n'importe quel gène spécifique à une cellule, ce qui permet une régulation précise de l'expression du gène rapporteur et, par conséquent, un marquage cellulaire fiable.

Des modèles génétiquement modifiés ont été mis au point afin de :

• Marquer une lignée unicellulaire à l'aide d'un biomarqueur spécifique à la lignée cellulaire d'intérêt.
• Marquer une sous-population issue d'une lignée unicellulaire, à savoir les cellules activées, telle que définie par l'expression d'un biomarqueur spécifique.

Étude de cas n° 1 : un modèle « knock-in » Sox9-eGFP permet de suivre les modifications spécifiques à chaque stade de la masse de Sertoli et de cellules germinales dans le testicule en développement.

D'après Nel-Themaat et al., Dev Dyn 2009. Analyse morphométrique de la formation du cordon testiculaire chez les souris Sox9-EGFP.

Les cellules marquées permettent d'étudier le trafic cellulaire

Entre les stades E11,5 et E12,5, l'épaisseur des testicules augmente et les premiers signes de différenciation apparaissent.

Formation de petites protubérances au niveau de la masse de Sertoli et des cellules germinales.

Zones distinctes, non fluorescentes, au sein de la masse tissulaire.

Étude de cas n° 2 : Les souris Knockin exprimant un transporteur de la dopamine (DAT) marqué par un épitope d'hémagglutinine (HA) permettent d'étudier le trafic du transporteur endogène.

D'après Rao et al., FASEB J 2012. Des souris « knock-in » présentant un transporteur de la dopamine marqué par un épitope révèlent un trafic endocytaire rapide et un ciblage des filopodes par ce transporteur dans les axones dopaminergiques.

Des vésicules marquées permettent de mener des études sur le transport

Localisation de la DAT dans les axones des neurones dopaminergiques (DA). Vue d'une partie d'un prolongement axonal.

Les vésicules intracellulaires HA-DAT ont présenté un mouvement bidirectionnel rapide. Les flèches rouges indiquent les vésicules se déplaçant de manière rétrograde ; les flèches vertes indiquent celles se déplaçant de manière antérograde. La durée (en secondes) est indiquée.

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Modèles pour la médecine translationnelle : reproduire les maladies humaines – suppression de cellules à l'aide de gènes suicides

Le recours à des techniques d'ablation cellulaire permet de supprimer, à volonté, un type de cellule donné au sein d'un organisme. La déplétion cellulaire constitue un outil de recherche puissant qui trouve deux applications principales :

• La reproduction de maladies humaines ou d'effets secondaires de médicaments. La réduction des populations cellulaires in vivo permet de reproduire de manière fiable ces pathologies (hépatite, maladies neurodégénératives, etc.).
• L'amélioration de l'efficacité des xénogreffes. Il peut également s'avérer utile d'éliminer partiellement ou totalement les cellules endogènes de l'organe ou de l'organisme receveur.

À cette fin, un gène suicide sera ciblé à l’aide de la technologie d’humanisation et de « knock-in », de sorte qu’il ne s’exprime que dans le type cellulaire à éliminer. À ce stade, le gène suicide n’a aucun effet sur la cellule. Lorsqu’un médicament spécifique au gène suicide utilisé est administré aux animaux, ce dernier métabolise le médicament en créant des métabolites toxiques, ce qui entraîne la mort des cellules exprimant le gène suicide (mais pas celle des autres cellules qui ne réagissent pas au médicament).

Étude de cas : inactivation cellulaire induite par la toxine diphtérique.

D'après Wu et al., Development, 2006. Les motoneurones et les oligodendrocytes sont générés successivement à partir de cellules souches neurales, mais ne semblent pas partager de progéniteurs communs spécifiques à leur lignée in vivo.

La population cellulaire cible est éliminée

Les embryons de souris exprimant la toxine diphtérique (DT) dans les cellules Olig1+ (Olig1-DTA) ne présentent pas de motoneurones.

I, J, M, N) Coupe cérébrale d'une souris de type sauvage, montrant la présence normale de motoneurones.

K, L, O, P) Les motoneurones de la souris transgénique exprimant la protéine DT (Olig1-DTA) sont en grande partie absents.

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Modèles pour la médecine translationnelle : reproduction des maladies humaines – expression spécifique à un tissu et/ou à un moment donné des gènes responsables de la maladie

Certains modèles de maladies nécessitent la surexpression de gènes responsables de la maladie au sein de populations cellulaires spécifiques (inflammation, maladies neurodégénératives) et/ou pendant une période bien définie. Ces modèles murins permettent aux scientifiques d'étudier l'apparition de la pathologie et d'évaluer l'efficacité des composés.

À cette fin, des modèles murins pourraient être créés à l'aide de la technologie d'humanisation et de knock-in, en utilisant soit des loci permissifs (« safe harbour »), soit des loci de gènes cibles.

Étude de cas : la surexpression d'un gène responsable d'une maladie, induite de manière inductible, entraîne une leucémie et la mort de la souris.

D'après Carofino et al., Dis Model Mech 2013. Un modèle murin de surexpression inductible du gène Prdm14 entraîne l'apparition d'une leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T (LLA-T) à début rapide et à forte pénétrance.

Un modèle reproduit une maladie humaine

Les souris surexprimant le gène Prdm14 reproduisent efficacement la maladie humaine (leucémie lymphoblastique aiguë) en reproduisant le phénotype humain.

Après l'induction, les souris présentaient une hypertrophie du thymus et de la rate (flèches), ainsi que des reins, du foie et des ganglions lymphatiques (données non présentées).

Après l'induction, les souris ont développé une leucémie lymphoblastique aiguë et en sont mortes très rapidement.

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Modèles pour la médecine translationnelle : reproduire les maladies humaines – humanisation à l'aide de gènes mutants humains

Les études génomiques mettent en évidence une corrélation statistique entre la présence de mutations et la pathologie (apparition, évolution, létalité, etc.), sans pour autant établir de lien de causalité. La création de modèles murins présentant une substitution du gène de type sauvage par une version mutante (murine ou humaine) permet d'étudier le rôle des mutations dans la maladie et, par conséquent, les mécanismes à l'origine de son étiologie et de sa progression.

Étude de cas : Induction d'une maladie humaine chez la souris – affection de type maladie de Paget.

D'après Daroszewska et al., Hum Mol Genet 2011. Une mutation ponctuelle dans le domaine associé à l'ubiquitine de la protéine SQSMT1 suffit à provoquer chez la souris une affection de type maladie de Paget.

Un modèle reproduit une maladie humaine

Les souris présentant la mutation ponctuelle humaine P394L développent une affection de type maladie de Paget.

Analyse par microtomographie des os longs de souris porteuses de la mutation P394L et de souris de type sauvage (WT). Les souris mutantes présentent de multiples lésions ostéolytiques focales pénétrant dans le cortex (flèches).

Image micro-tomographique axiale de la 5e vertèbre lombaire.

(N) Souris WT présentant une morphologie et une structure trabéculaire normales.

(O) Souris P394L+/+ présentant une lésion ostéosclérotique occupant la majeure partie du corps vertébral.

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Expression de transgènes spécifique à certains tissus

Le profil d'expression et le niveau d'expression spécifiques d'un transgène (recombinase Cre ou Flp, gènes rapporteurs, « safe harbour », gène cible, etc.) constituent des paramètres clés des modèles transgéniques pertinents.

L'insertion ciblée du transgène, c'est-à-dire son insertion à un emplacement spécifique et prédéterminé du génome, permet une régulation optimale de son expression. Le promoteur endogène complet de la souris (comportant tous les éléments régulateurs, y compris les amplificateurs et les répresseurs situés à plusieurs kilo-bases de distance) contrôlera la régulation du transgène.

La technologie Knockin est devenue la référence en matière d'expression spécifique à un tissu, car elle permet de déterminer le profil d'expression du transgène ainsi que son niveau d'expression. De nombreux types de modèles ont été créés, notamment :

• Expression spécifique à certains tissus de la protéine Cre et de la recombinase Flp (⤏ voir aussi : recombinaison spécifique à un site)
• Suivi de l'expression génique à l'aide d'un gène rapporteur, tel que les protéines fluorescentes (⤏ voir aussi : souris rapporteuses ou lignées cellulaires)
• Insertion d'un transgène dans un « safe harbour » tel que Rosa26 ou le locus Hprt (⤏ voir également les souris « Quick Knockin » ou les lignées cellulaires)
• Humanisation du gène d'intérêt (⤏ voir aussi les modèles murins « knock-in » humanisés)

Étude de cas n° 1 : Cinétique de repopulation des cellules souches intestinales chez des souris Cre inductibles par le tamoxifène.

D'après Sangiorgi et al., Nat Genet 2008. Le gène Bmi1 est exprimé in vivo dans les cellules souches intestinales.

Expression observée dans la sous-population ciblée

Les cellules Cre+ exprimant Bmi1+ repeuplent les cryptes de l'intestin grêle.

La fonction Cre est détectée (coloration au lacZ) dans la lignée cellulaire Bmi1+.

La repopulation commence au jour 2 (a) après l'injection de tomoxifène. Les premières cryptes entièrement marquées sont visibles au jour 17 (i).

Étude de cas n° 2 : Expression spécifique de la recombinase Cre dans les neurones et les oligodendrocytes.

D'après Battiste et al., Development, 2007. Le gène Ascl1 définit les cellules précurseurs neuronales et oligodendrocytaires à lignée restreinte, générées de manière séquentielle dans la moelle épinière.

Expression obtenue dans la lignée cellulaire ciblée

Les cellules Cre+ exprimant Ascl1 donnent naissance à des neurones et à des oligodendrocytes.

La fonction Cre est détectée (coloration au lacZ) dans les neurones sympathiques en développement.

L'expression commence tout juste à E10,5, mais elle est clairement visible à E11,5.

Étude de cas n° 3 : Expression spécifique de la recombinase Cre dans les glandes salivaires.

D'après Bullard et al., Dev Biol 2008. L'expression de l'Ascl3 identifie une population de cellules progénitrices à l'origine à la fois des cellules acineuses et des cellules canalaires dans les glandes salivaires de la souris.

Expression obtenue dans des cellules exprimant le biomarqueur

L'expression de la recombinase Cre reproduit l'expression endogène d'Ascl3.

Les flèches indiquent les cellules canalaires de la glande sous-mandibulaire dans lesquelles les cellules Cre+ exprimant Ascl3 sont marquées en rouge à l'aide d'anticorps dirigés contre la recombinase Cre.

Ac : cellules acineuses ; Du : cellules canalaires.

Validation des cibles et modèles « knock-out » : modèles « knock-out » constitutifs avec suivi du profil d'expression génique

Grâce à cette technologie Knockin, un gène rapporteur inséré permet de déterminer le profil d'expression du gène d'intérêt. L'expression dans des conditions physiologiques normales constitue une information précieuse, mais ce qui est encore plus intéressant, c'est que ce modèle permet un suivi fiable et simple de l'expression dans des conditions pathologiques, lors de régimes alimentaires particuliers ou en situation de stress, etc.

Étude de cas : Création d'un modèle « knock-out » pour le gène MCT1 et « knock-in » pour le gène LacZ, destiné à valider le gène MCT1 en tant que cible dans le traitement de l'obésité.

D'après Lengacher et al., PLoS One 2013, « Résistance à l'obésité d'origine alimentaire et aux perturbations métaboliques associées chez des souris présentant une haploinsuffisance du transporteur de monocarboxylates 1 ».

Les souris ^MCT1+/- présentent une résistance à l'obésité d'origine alimentaire.

Les souris MCT1 ^+/- sont pratiquement impossibles à distinguer des souris ^MCT1+/+ lorsqu'elles sont nourries avec une alimentation standard.

Soumises à un régime riche en graisses, les souris ^MCT1+/+ ont pris beaucoup de poids et sont devenues obèses.

En revanche, les ^{souris MCT1+/-} nourries avec le même régime alimentaire sont restées minces.

Suivi efficace de l'expression des gènes cibles

LacZ Knockin permet de suivre l'expression génique.

Le gène LacZ est exprimé sous le contrôle du promoteur endogène de MCT1, et son expression permet de mieux comprendre le profil d'expression de MCT1.

Validation des cibles et modèles de knock-out : modèle de knock-out conditionnel avec suivi de l'efficacité de l'ablation génique

Les modèles de « knockout » conditionnel, qu’ils soient spécifiques à un tissu ou inductibles, sont désormais couramment utilisés pour étudier les fonctions des gènes et valider des cibles. L’efficacité de la délétion conditionnelle (c’est-à-dire le nombre de cellules du tissu étudié dans lesquelles les deux allèles sont délétés) est un paramètre clé pour la qualité et la fiabilité du modèle. Afin de contrôler cette efficacité et de valider la fiabilité du modèle, les scientifiques utilisent désormais cette technologie pour cibler un gène rapporteur situé au locus d’intérêt, qui s’active lorsque la délétion se produit. La mesure de l’expression du gène rapporteur permet de quantifier le niveau de délétion obtenu au niveau tissulaire ou cellulaire, indiquant ainsi quelles cellules sont inactivées et lesquelles ne le sont pas. En offrant un moyen de valider l’efficacité de la délétion conditionnelle, cette technologie permet la création de modèles de délétion conditionnelle fiables et précieux pour la validation des cibles.

Étude de cas : Suivi in vivo de cellules knock-out en l'absence d'anticorps adapté.

D'après Schnütgen et al., Nat Biotechnol 2003, « Une stratégie directionnelle pour le suivi de la recombinaison médiée par Cre au niveau cellulaire chez la souris ».

Suivi efficace du gène inactivé

Suivi d'une délétion, induite par Cre, d'un gène d'intérêt (récepteur gamma de l'acide rétinoïque).

Avant l'induction, aucune coloration n'a été détectée (en haut).

Après induction, une activité du gène rapporteur a été détectée dans les cellules exprimant la protéine Rar gamma (en bas).