Édition génétique par CRISPR/Cas9

Structure et mécanismes d'action de CRISPR/Cas9

Un système de nucléase CRISPR/Cas9 nécessite deux composants : une enzyme Cas chargée de couper la séquence cible et un ARN guide unique (sgRNA), qui se lie à la séquence cible de 20 paires de bases (pb). La séquence cible (complémentaire de la séquence de l'ARN guide simple) est suivie de deux nucléotides cytosine, car l'ARN guide simple se lie mieux lorsque le brin d'ADN opposé est constitué d'un nucléotide quelconque suivi de deux guanines (-NGG). Cette séquence est appelée « séquence PAM » (Protospacer Adjacent Motif). La séquence PAM varie en fonction de l'origine de Cas9.

La technologie CRISPR/Cas9 crée des cassures double brin spécifiques au niveau du locus cible, ce qui déclenche des mécanismes de réparation de l'ADN. Ces corrections donnent lieu à deux types de modifications génomiques : des « knock-out » (KO) constitutifs par jonction non homologue des extrémités et des « knock-in » (KI) par recombinaison homologue.

• Un système CRISPR/Cas9 est un système simple de reconnaissance par appariement d'une seule base qui nécessite une courte séquence PAM située en aval de la séquence cible.
• La conception sur mesure de nucléases CRISPR/Cas9 est la plus simple parmi les différentes nucléases (par exemple, TALEN, ZNF).

Les données publiées ainsi que nos données internes (voir les paragraphes ci-dessous) démontrent clairement que la composition des séquences est un facteur clé qui détermine l'efficacité et la spécificité de l'action in vivo de CRISPR/Cas9.

Efficacité de CRISPR/Cas9

La simplicité de la conception ne garantit pas une efficacité élevée. La littérature montre que, dans les cellules eucaryotes et chez les rongeurs, l'efficacité varie considérablement d'une séquence cible à l'autre.

Depuis 2013, genOway investit massivement dans la conception de nucléases CRISPR/Cas9 et dans l'optimisation des protocoles afin d'obtenir une efficacité élevée. Les paramètres suivants se sont avérés essentiels :

• Structure des régions génomiques
• Effets hors cible prévus faibles
• Protocoles d'injection

Figure 1. Efficacité de coupure de CRISPR/Cas9
Nous avons compilé les données issues de 20 articles évalués par des pairs (réf. 4 à 23) décrivant l'efficacité de 97 conceptions différentes de CRISPR/Cas9 chez des rongeurs ou dans des systèmes cellulaires, et nous les avons comparées aux données non publiées que nous avons obtenues à partir de 88 conceptions différentes de CRISPR/Cas9.

Résultats :

Nous avons obtenu une efficacité de coupure élevée pour 69 % de nos conceptions CRISPR/Cas9.

• Certaines nucléases CRISPR/Cas9 présentent une activité très faible, voire parfois à peine détectable. Si la qualité et les performances de cette technologie sont certes élevées, il ne faut toutefois pas en faire une promotion excessive ni la surestimer. Cette technologie n’est pas encore totalement fiable.
• genOway a optimisé la conception des séquences et amélioré les protocoles d'injection afin d'obtenir une efficacité élevée du système CRISPR/Cas9.

Activité hors cible de CRISPR/Cas9

L'un des principaux inconvénients de cette technologie de nucléase réside dans la coupure non spécifique (hors cible) de séquences génomiques. Ces mutations « supplémentaires » dans le génome peuvent fortement influencer le phénotype du modèle généré.

Comme pour les animaux transgéniques (insertion aléatoire), il est vivement recommandé d'analyser plusieurs lignées indépendantes d'animaux mutants afin de démontrer statistiquement le lien entre la modification génétique et le phénotype observé.

Les événements hors cible liés à CRISPR/Cas9 peuvent s'expliquer par deux mécanismes moléculaires distincts :

• La nucléase Cas9 cible une séquence spécifique, mais des séquences légèrement différentes (séquences dégénérées) peuvent également être reconnues et coupées. Ces mécanismes de coupure hors cible peuvent être étudiés en séquençant les séquences cibles dégénérées.
• La nucléase Cas9 pourrait effectuer des coupures aléatoires au sein du génome : un mécanisme moléculaire a été proposé. Selon ce mécanisme, lorsque le complexe de nucléase analyse l'ADN à la recherche de séquences spécifiques, des coupures aléatoires peuvent se produire. Cette activité hors cible ne peut être mesurée que par séquençage du génome entier.

Une forte activité hors cible a été mise en évidence pour les ZFN et les TALEN. Les systèmes de nucléases CRISPR/Cas9 produisent également des effets hors cible, mais dans une moindre mesure que les ZFN et les TALEN. Il est toutefois encore trop tôt pour déterminer si cette différence est statistiquement significative.

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Figure 2.
La quantification des effets hors cible du système CRISPR/Cas9 est décrite dans 18 publications récentes. (Réf. 5, 7 à 10, 13 à 17, 19, 20, 22, 24 à 27)

Résultats :

Preuve évidente que des effets hors cible existent et peuvent être très importants.

Tous les modèles développés par genOway font l'objet d'une validation systématique visant à garantir une activité hors cible minimale. La conception de nos nucléases CRISPR/Cas9 est rigoureuse afin de minimiser les effets hors cible (voir « Programmes de R&D en cours chez genOway », ci-dessous).

Fond génétique utilisé avec les nucléases CRISPR/Cas9

La plupart des laboratoires utilisent des souches de souris non consanguines ou hybrides (par exemple, FVB, B6D2) pour leurs expériences, car celles-ci offrent des conditions expérimentales favorables (par exemple, un plus grand nombre d'embryons, un taux de survie élevé après l'injection, un plus grand nombre de petits obtenus par injection d'embryon).

Néanmoins, un modèle génétiquement modifié présente généralement une plus grande valeur scientifique lorsqu'il est issu d'une lignée consanguine. genOway a développé sa plateforme CRISPR/Cas9 en utilisant des lignées génétiques C57BL6.

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Figure 3.
Onze systèmes de nucléases CRISPR/Cas9 déjà publiés ont été testés sur des embryons C57BL6 (réf. 14, 15, 21, 23, 28-31), tandis que genOway dispose d'une expérience cumulée de 97 conceptions qui ont été testées avec succès et validées sur des embryons C57BL6.

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genOway possède une vaste expérience dans l'application de la technologie des nucléases CRISPR/Cas9 au fond génétique C57BL6, grâce à des protocoles et des procédures adaptés à ce fond génétique fragile.

Pour les modèles murins, genOway a mis en place une offre standard basée sur la souche Sprague-Dawley (SD). D'autres souches sont en cours de développement.

Modèles de knock-out constitutif : types de mutations induites par les nucléases CRISPR/Cas9

L'utilisation de nucléases pour la mise au point de modèles KO repose sur le mécanisme NHEJ (jonction des extrémités non homologues), qui induit une mutation dans la séquence cible.

Figure 4.
La plupart des mutations induites par la nucléase CRISPR/Cas9 sont des mutations de petite taille.

Nous avons analysé de manière systématique le type de mutations générées par 10 configurations différentes de CRISPR/Cas9 chez 121 mutants, obtenus par injection de Cas9 dans des zygotes C57BL6.
La ligne verticale noire représente le site de coupure.
Les points gris représentent les délétions, les points verts les insertions et les points bleus les mésappariements.

Résultats :

Soixante-seize pour cent (76 %) de l'ensemble des mutations sont des mutations de petite taille, inférieures à 12 pb (68 % de petites délétions et 8 % de petites insertions).

Les nucléases CRISPR/Cas9 induisent de petites mutations au sein de la séquence cible. Ces petites mutations permettent de développer (concevoir et créer) des modèles KO constitutifs de manière plus fiable qu’avec les TALEN ou les ZFN.

Modèles « Knockin » : types de mutations créées par les nucléases CRISPR/Cas9

L'utilisation de nucléases pour créer des modèles « knock-in » (KI) constitue un objectif majeur. La communauté scientifique est confrontée à deux défis particuliers :

• La conception d'un modèle KI nécessite un positionnement précis de l'insertion. Par conséquent, la flexibilité de conception de la séquence cible est limitée.
• Les événements de recombinaison homologue induits par une nucléase sont beaucoup moins fréquents que les mutations induites par une nucléase. Par conséquent, l'efficacité de la nucléase doit être élevée.

Néanmoins, des résultats très prometteurs ont déjà été obtenus grâce à l’utilisation des nucléases CRISPR/Cas9 pour créer des KI à partir de petits fragments d’ADN ou de transgènes (réf. 25; résultats de genOway, figures 5a, b et 8a, b).

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Figure 5a. Stratégie de knock-in par CRISPR/Cas9 utilisant de petits fragments d’ADN comportant un site loxP (souche de référence : C57BL6) . A) Description des loci endogènes comportant un site loxP et des loci recombinés comportant le site de digestion. B) Détection des événements de recombinaison homologue (RH) par PCR suivie d’une digestion. C) Les produits de PCR ont été séquencés pour confirmer le knock-in par RH. D) Données expérimentales.

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Figure 5b. Stratégie de knock-in CRISPR/Cas9 utilisant un oligonucléotide simple brin portant une mutation ponctuelle (souche de référence : C57BL6). A) Description des loci endogènes et recombinés. B) Les produits de PCR ont été séquencés afin d’identifier l’événement de knock-in. C) Données expérimentales.

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Figures 6a et 6b.
Insertions d'un transgène dans deux gènes codant pour des cytokines à l'aide de CRISPR/Cas9 (souche de référence : C57BL6)

Les programmes de R&D en cours chez genOway

a) Modèles à cibles multiples utilisant CRISPR/Cas9

Le ciblage multiple (mutation de plusieurs cibles dans un même embryon ou une même cellule) est possible grâce à la technologie de nucléases CRISPR/Cas9.
Des publications décrivent le ciblage simultané de deux à cinq gènes chez la souris (réf. 7, 14, 25), chez le rat (réf. 20, 22) et dans des cellules (réf. 4).
Le taux de réussite varie et dépend de l’efficacité de chaque système CRISPR/Cas9.

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Figure 7.
genOway a testé des protocoles permettant de cibler efficacement plusieurs sites du génome murin. D’après notre expérience, le paramètre clé est l’efficacité relative des différents systèmes CRISPR/Cas9 utilisés.

b) Délétions de grande taille à l'aide de CRISPR/Cas9

Figure 8. Suppression génomique de «
» à l’aide de deux systèmes CRISPR/Cas9 (souche de référence : C57BL6)

A) Description des loci endogènes et délétés.
B) La délétion a été détectée à l'aide d'une amorce couvrant la séquence à déléter (WT : 1 261 pb ; délétion : 731 pb). Les produits de PCR ont été séquencés afin de confirmer la délétion. Sur les 9 échantillons, seuls les échantillons 2 et 6 présentent la délétion attendue.

Les suppressions vont de la taille attendue à plusieurs suppressions plus petites.

Nous travaillons actuellement à la mise au point de protocoles permettant de supprimer de manière efficace et fiable des séquences génétiques d'une longueur pouvant atteindre 5 kb.

c) Effets hors cible de CRISPR/Cas9

Nous menons actuellement plusieurs programmes axés sur les effets hors cible :

• Définir des procédures et des protocoles permettant de détecter efficacement les effets hors cible sur des séquences similaires à la séquence ciblée (séquences dégénérées) ainsi que sur des séquences non apparentées (coupe aléatoire).
• Réduire l'activité hors cible 1) en appliquant des règles plus strictes pour la conception des nucléases CRISPR/Cas9 et 2) en optimisant les protocoles d'injection afin de réduire l'activité des nucléases (qualité et durée).

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Brevets CRISPR-Cas9 : ne vous y perdez pas !

Pourquoi pas ?
Parce qu’il n’existe que trois portefeuilles de brevets fondamentaux!

Afin de protéger ses clients contre les risques de contrefaçon, genOway a réalisé d'importants investissements pour acquérir des licences couvrant l'ensemble de ces trois portefeuilles.

Par conséquent :

• Nos clients sont autorisés à utiliser les modèles CRISPR-Cas9 à des fins de R&D (interne ou commerciale) sans avoir à obtenir de licence supplémentaire auprès d'un tiers.
• Vous pouvez obtenir auprès de genOway l'autorisation nécessaire au développement ou à l'utilisation en interne de modèles de rongeurs provenant de fournisseurs tiers.

^{Chaque brevet délivré est représenté par un point de couleur.}

Les trois principaux portefeuilles de brevets dans le domaine des eucaryotes proviennent de :

1. Sigma-Aldrich, également connu sous le nom de Merck, qui propose tout système CRISPR-Cas9 permettant de modifier un ADN cible et entraînant une cassure double brin (ce système peut être associé à une séquence exogène pour réaliser un « knock-in »)
2. Berkeley, qui porte sur tout système CRISPR-Cas9 permettant de modifier une séquence cible à l'aide d'au moins un ARN guide
3. « Broad », qui englobe tout système CRISPR-Cas9 destiné à modifier une séquence cible, lorsque le système CRISPR est introduit dans les cellules sous forme de vecteurs