Technologie FLEx et optogénétique : contrôler l'expression génique avec une haute résolution spatiale et temporelle

Il y a quelques décennies encore, le cerveau restait un mystère, non pas par manque de curiosité intellectuelle de la part des scientifiques, mais plutôt en raison des technologies limitées dont ils disposaient. Ces dernières années, cependant, des avancées technologiques remarquables ont conduit les chercheurs au seuil d'une révolution dans le domaine des neurosciences modernes, une ère où des technologies telles que FLEx et l'optogénétique se rejoignent, permettant ainsi aux scientifiques d'étudier les fondements mêmes du fonctionnement et des dysfonctionnements du cerveau.

Commençons par les bases : qu'est-ce que l'optogénétique ?

Optogénétique : contrôler les neurones à l'aide de la lumière

En 2005, une équipe de l'université de Stanford, dirigée par le neurobiologiste Karl Deisseroth, a combiné des méthodes optiques et génétiques pour photostimuler des neurones de mammifères et modifier les événements synaptiques : une nouvelle technologie voyait le jour, et le terme « optogénétique » a été inventé (Boyden et al., 2005 ; Deisseroth et al., 2006).

Malgré son développement relativement récent, l’histoire de l’optogénétique remonte à près de 50 ans, avec la découverte des rhodopsines microbiennes, des protéines photosensibles qui absorbent des photons en vue d’une conversion énergétique ou de l’activation de voies de signalisation intra- ou intercellulaires (Ernst et al., 2014). Les rhodopsines microbiennes sont codées par des gènes d’opsine et comprennent les bactériorhodopsines, les halorhodopsines et les channelrhodopsines, les deux premières étant présentes chez les archées, la troisième chez les algues vertes (Oesterhelt et Stoeckenius, 1971 ; Matsuno-Yagi et Mukohata, 1977 ; Foster et al., 1984 ; Harz et Hegemann, 1991). Ces protéines contrôlent le flux de charges électriques à travers les membranes cellulaires et maintiennent le potentiel membranaire en réponse à la lumière visible (Zhang et al., 2011).

Qu'ont en commun les rhodopsines microbiennes et les neurones ? Les stimulations neuronales sont déclenchées par le mouvement d'ions à travers la membrane de l'axone : dès qu'un certain nombre d'ions positifs traverse la membrane cellulaire, un seuil est atteint et le neurone se déclenche, envoyant le signal électrique le long de l'axone (Lodish et al., 2000). La plupart des neurones du cerveau ne sont pas naturellement sensibles à la lumière ; ainsi, l’expression sélective de gènes d’opsine dans des cellules ciblées permet de contrôler l’activité neuronale avec une spécificité bien supérieure à celle que l’on peut obtenir à l’aide de méthodes pharmacologiques ou électrophysiologiques (Deisseroth, 2011 ; Mei et Zhang, 2012 ; Towne et al., 2016).

La neuromodulation optogénétique est rendue possible par la lumière : lorsqu’elles sont exposées à la bonne longueur d’onde, les rhodopsines microbiennes permettent aux ions de traverser la membrane de l’axone, contrôlant ainsi l’activité neuronale (Bernstein et Boyden, 2011 ; Mei et Zhang, 2012). Par exemple, la lumière bleue active les channelrhodopsines qui, à leur tour, déclenchent une excitation neuronale, tandis que la lumière jaune active les halorhodopsines pour inhiber l'activité neuronale (Figure 1) (Wiegert et al., 2017).

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Figure 1 | Image tirée du site https://i1.wp.com/sitn.hms.harvard.edu/wp-content/uploads/2016/04/Lyon_2.png

Comment faire passer une opsine dans le cerveau ?

Afin d’exprimer des opsines au sein du cerveau, les chercheurs injectent des virus génétiquement modifiés codant pour des rhodopsines microbiennes dans des régions cérébrales spécifiques. Les neurones ainsi infectés par le virus sont ensuite photostimulés à l’aide de canules à fibres optiques directement implantées au niveau du site d’injection et reliées à un laser. Le laser émet des impulsions lumineuses de longueurs d’onde spécifiques, activant ou désactivant de manière sélective l’activité neuronale (Atasoy et al., 2008 ; Taylor et al., 2016 ; Hooper et Maguire, 2016).

Les virus adéno-associés recombinants (rAAV) sont de plus en plus utilisés pour l’administration de gènes dans le système nerveux central en raison de leur expression extrachromosomique à long terme relativement stable et de leur faible capacité à induire des réponses immunitaires innées (Fenno et al., 2011). Cependant, les rAAV ne sont pas capables d’infecter spécifiquement des sous-populations neuronales définies, ce qui constitue un inconvénient majeur en optogénétique (Belzung et al., 2014). Ce problème pourrait être surmonté en fusionnant des gènes d’opsine à des promoteurs spécifiques à un type cellulaire ; toutefois, ceux-ci n’induisent généralement qu’une faible expression des gènes en aval. À l’inverse, les promoteurs puissants spécifiques à un type cellulaire sont trop longs pour les rAAV, qui ne peuvent intégrer que des séquences inférieures à 5 kb (Hirsch et al., 2016 ; Hudry et Vandenberghe, 2019). Comment alors obtenir une expression forte de l’opsine dans des types de cellules neuronales spécifiques ? C’est là que FLEx entre en scène !

FLEx : Une lumière quand la nuit tombe !

Le commutateur FLEx (pour « flip-excision »), également connu sous les noms de DIO (Double-floxed Inverse Orientation) ou DO (Double-floxed Orientation), est un outil très puissant qui permet un contrôle précis, tant temporel que spatial, de l’expression génique in vivo (Schnütgen et al., 2003). Ce contrôle est rendu possible grâce à des recombinases spécifiques de site, telles que Cre ou Flp, qui induisent une recombinaison de l’ADN au niveau de sites de reconnaissance définis (à savoir, respectivement, loxP et FRT) (Abremski et Hoess, 1984 ; Van Duyne, 2001 ; Christenson Wick et Krook-Magnuson, 2018).

Les vecteurs optogénétiques FLEx contiennent un promoteur puissant situé en amont d’un gène d’opsine (par exemple, la channelrhodopsine-2, ChR2) fusionné à un gène rapporteur (par exemple, mCherry) afin de détecter facilement les cellules exprimant l’opsine. Le gène de fusion ainsi obtenu est inséré en sens antisens par rapport au promoteur afin d’empêcher son expression, et est flanqué (« floxé ») de deux paires de sites de reconnaissance incompatibles (par exemple, loxP et lox511) orientés en sens inverse. Comme Cre ne provoque pas de recombinaison entre des sites de reconnaissance non appariés, sa présence induit d’abord l’inversion de l’opsine, puis l’excision des sites lox, verrouillant ainsi l’opsine dans l’orientation correcte pour être transcrite (figure 2) (Sharma et Zhu, 2014).

Comment FLEx permet-il une expression forte de l'opsine dans des cellules neuronales spécifiques ? Cela est possible grâce à l'utilisation de virus dépendants de Cre, tels que les vecteurs optogénétiques FLEx, en association avec des animaux transgéniques ou des rAAV exprimant Cre sous le contrôle d'un promoteur spécifique à un type cellulaire. Une fois injectés dans le cerveau, les virus infectent toutes les cellules possédant un gène d'opsine inactif ; cependant, dans les cellules exprimant Cre, ce dernier induit la recombinaison de la construction d'opsine à double flox, permettant ainsi son expression sous le contrôle d'un promoteur puissant uniquement dans des cellules neuronales spécifiques. FLEx garantit ainsi une précision spatiale et une expression forte de l’opsine, deux éléments essentiels en optogénétique pour étudier les processus physiologiques et comportementaux (Abdallah et al., 2018 ; Deubner et al., 2019).

Figure 2 | La stratégie du commutateur FLEx. L'expression de ChR2-mCherry est un événement médié par Cre : en l'absence de la recombinase, la séquence ChR2-mCherry orientée en sens inverse n'est pas exprimée. Des sites loxP (triangles violets) et lox511 (triangles bleus) orientés en sens inverse permettent une recombinaison médiée par Cre et l'inversion de la séquence ChR2-mCherry par rapport au promoteur, ce qui permet son expression. ChR2, channelrhodopsine-2. Figure adaptée d'Atasoy et al., 2008.

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Par exemple, Taylor et ses collègues ont utilisé des vecteurs rAAV FLEx pour étudier les circuits neuronaux à l’origine des mécanismes du sommeil et de l’anesthésie. Chez des souris transgéniques Cre, ils ont ciblé les neurones dopaminergiques (DA) de la zone tegmentale ventrale (VTA) du cerveau, une région dont on savait déjà qu’elle jouait un rôle important dans la régulation du sommeil. Ils ont notamment constaté que la stimulation optogénétique de ces neurones DA produisait des signes comportementaux et électroencéphalographiques d’éveil chez des souris préalablement soumises à une anesthésie générale en état stable (Taylor et al., 2016).

Il est intéressant de noter que ces mêmes neurones jouent également un rôle central dans les comportements motivés (Juarez et Han, 2016). Il n’y a pas si longtemps encore, cependant, on ignorait totalement quelle sous-population de neurones dopaminergiques pouvait activer des stimuli appétitifs plutôt qu’aversifs. Dans un article récent, de Jong et ses collègues ont utilisé des vecteurs rAAV FLEx pour répondre à cette question, en cartographiant et en caractérisant l’activité des neurones dopaminergiques du VTA. À l’aide de stimulations optogénétiques in vivo, ils ont enregistré simultanément les impulsions électriques de sous-populations distinctes de cette zone cérébrale, démontrant qu’il est possible de séparer les entrées neuronales pour induire des comportements liés à l’aversion ou à la récompense. La grande précision spatio-temporelle et la modulation réversible des vecteurs FLEx, associées à l’utilisation de plusieurs souris transgéniques Cre ciblant différentes zones cérébrales, ont permis de dresser une topographie détaillée et fonctionnelle de l’architecture des circuits neuronaux des régions cérébrales associées aux comportements motivés (de Jong et al., 2019). Les vecteurs FLEx constituent donc un outil idéal en complément de l’optogénétique pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires du cerveau in vivo.

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Références :

Abdallah, Khaled et al. « Administration de la recombinase Cre par le virus adéno-associé 2/9 dans les fibres afférentes primaires de souris ». Scientific Reports 8 (2018) 7321. PMID : 29743652. PMCID : PMC5943452.

Abremski, Ken et Ronald Hoess. « Recombinaison spécifique au site du bactériophage P1. Purification et propriétés de la protéine recombinase Cre. » The Journal of Biological Chemistry 259 (1984) : 1509-1514. PMID : 6319400.

Atasoy, Deniz et al. « Un commutateur FLEX permet de diriger la channelrhodopsine-2 vers plusieurs types de cellules à des fins d'imagerie et de cartographie des circuits à longue portée. » The Journal of Neuroscience : revue officielle de la Society for Neuroscience 28 (2008) : 7025-7030. PMID : 18614669.

Belzung, Catherine et al. « L'optogénétique au service de l'étude des circuits neurobiologiques des comportements liés à la peur et à la dépression : une analyse critique ». Pharmacology, Biochemistry and Behavior 122 (2014) : 144-157. PMID : 24727401.

Bernstein, Jacob G. et Edward S. Boyden. « Outils optogénétiques pour l'analyse des circuits neuronaux du comportement ». Trends in cognitive sciences 15 (2011) : 592-600. PMID : 22055387. PMCID : PMC3225502.

Boyden, Edward S., et al. « Contrôle optique de l'activité neuronale à l'échelle de la milliseconde, ciblé génétiquement. » Nature Neuroscience 8 (2005) : 1263-1268. PMID : 16116447.

Christenson Wick, Zoé et Esther Krook-Magnuson. « Spécificité, polyvalence et développement continu : le potentiel de l’optogénétique pour la recherche sur l’épilepsie ». Frontiers in cellular neuroscience 12 (2018). PMID : 29962936. PMCID : PMC6010559.

de Jong, Johannes W, et al. « Un mécanisme de circuit neuronal pour le codage des stimuli aversifs dans le système dopaminergique mésolimbique ». Neuron (2019) 133-151. PMID : 30503173. PMCID : PMC6317997.

Deisseroth, Karl, et al. « Technologies optiques de nouvelle génération pour l'illumination de circuits cérébraux ciblés génétiquement ». Journal of Neuroscience 26 (2006) : 10380-10386. PMID : 17035522. PMCID : PMC2820367.

Deisseroth, Karl. « Optogénétique ». Nature Methods 8 (2011) : 26-29. PMID : 21191368.

Deubner, Jan, et al. « Approches optogénétiques pour l'étude du cerveau des mammifères. » Current Opinion in Structural Biology, 57 (2019) : 157-163. PMID : 31082625.

Ernst, Oliver P., et al. « Rhodopsines microbiennes et animales : structures, fonctions et mécanismes moléculaires ». *Chemical Reviews* 114 (2014) : 126-63. PMID : 24364740. PMCID : PMC3979449.

Fenno, Lief et al. « The development and application of optogenetics ». Annual Review of Neuroscience 34 (2011) : 389-412. PMID : 21692661. PMCID : PMC6699620.

Foster, Kenneth W., et al. « Une rhodopsine est le photorécepteur fonctionnel responsable de la phototaxie chez l'eucaryote unicellulaire Chlamydomonas. » Nature 311 (1984) : 756-759. PMID : 6493336.

Harz, Hartmann et Peter Hegemann. « Courants calciques régulés par la rhodopsine chez Chlamydomonas ». Nature 351 (1991) : 489-491.

Hirsch, Matthew L. et al. « Delivering Transgenic DNA Exceeding the Carrying Capacity of AAV Vectors ». *Methods in molecular biology* 1382 (2016) : 21-39. PMID : 26611576. PMCID : PMC4971574.

Hooper, Andrew et Jamie Maguire. « Caractérisation d'un nouveau sous-type d'interneurones de l'hippocampe exprimant l'hormone de libération de la corticotropine. » Hippocampus 26 (2016) : 41-53. PMID : 26135556.

Hudry, Eloise et Luk H. Vandenberghe. « Transfert génique thérapeutique par AAV vers le système nerveux : une réalité clinique ». Neuron 101 (2019) : 839-862. PMID : 30844402.

Juarez, Barbara et Ming-Hu Han. « Diversité des circuits neuronaux dopaminergiques en réponse à l'exposition à des substances psychotropes ». Neuropsychopharmacology 41 (2016) : 2424-2446. PMID : 26934955. PMCID : PMC4987841.

Lodish, Harvey et al., *Biologie cellulaire moléculaire*. New York : W. H. Freeman, 2000. Référence : NBK21668.

Matsuno-Yagi, Akemi et Yasuo Mukohata. « Deux rôles possibles de la bactériorhodopsine : étude comparative de souches d'Halobacterium halobium présentant des différences de pigmentation ». Biochemical and Biophysical Research Communications 78 (1977) : 237-243. PMID : 20882.

Mei, Yuan et Feng Zhang. « Outils et approches moléculaires pour l'optogénétique ». Biological Psychiatry 71 (2012) : 1033-1338. PMID : 22480664. Oesterhelt, Dieter et Walther Stoeckenius. « Protéine de type rhodopsine issue de la membrane pourpre d'Halobacterium halobium ». *Nature : New Biology* 233 (1971) : 149-152. PMID : 4940442.

Schnütgen, Frank, et al. « Une stratégie ciblée pour le suivi de la recombinaison médiée par Cre au niveau cellulaire chez la souris. » Nature Biotechnology 21 (2003) : 562-565. PMID : 12665802.

Sharma, Suveena et Jinfang Zhu. « Applications immunologiques de la technologie de modification génétique conditionnelle chez la souris ». Current Protocols in Immunology 105 (2014) : 1-13. PMID : 24700321. PMCID : PMC4100247.

Taylor, Norman E., et al. « L’activation optogénétique des neurones dopaminergiques de la zone tegmentale ventrale induit la réanimation après une anesthésie générale. » Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113 (2016) : 12826-12831. PMID : 27791160. PMCID : PMC5111696.

Towne, Chris et Kimberly R. Thompson. « Aperçu de la recherche et des applications cliniques de l'optogénétique ». *Current Protocols in Pharmacology* 75 (2016) : 1-21. PMID : 27960028.

Van Duyne, Gregory D. « A structural view of cre-loxp site-specific recombination ». Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 30 (2001) : 87-104. PMID : 11340053.

Wiegert, J. Simon et al. « Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints ». Neuron 95 (2017) : 504-529. PMID : 28772120. PMCID : PMC5830081.

Zhang, Feng et al. « La famille des opsines microbiennes comme outils optogénétiques ». Cell 147 (2011) : 1446-1457. PMID : 22196724. PMCID : PMC4166436.