CRISPR : une boîte à outils bien fournie, mais pas de solution miracle

Si vous avez jeté un œil à la rubrique scientifique d’un journal au cours des deux dernières années, vous avez sans doute entendu parler de CRISPR, la dernière découverte prometteuse en matière d’ingénierie génomique. Le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) est en effet un outil puissant, que nous devons à nos petites amies, les bactéries. Il s’agit d’un système immunitaire adaptatif, le seul connu à ce jour chez les procaryotes, qui leur permet de mémoriser les agents pathogènes envahisseurs.(1) En intégrant dans leur génome une courte séquence d’ADN envahisseur, les bactéries peuvent par la suite reconnaître les intrus s’ils reviennent, et s’en débarrasser.

Depuis sa découverte, le système CRISPR/Cas a été modifié et adapté pour être utilisé dans une multitude de cellules eucaryotes à l’aide d’une seule protéine, une enzyme CRISPR capable de couper l’ADN, et d’une seule molécule d’ARN ciblant une séquence spécifique. Ce système incroyablement simple permet d’introduire des cassures double brin (DSB) à n’importe quel endroit de l’ADN, avec une précision au niveau du nucléotide. Environ cinq ans après sa première utilisation en tant que système programmable, tous les scientifiques le connaissent désormais, et la plupart ont réfléchi à la manière dont il pourrait dynamiser leurs recherches.

‍

D’un simple outil élégant permettant d’induire de manière ciblée des cassures double brin (DSB), CRISPR s’est transformé en une véritable boîte à outils débordante de possibilités. Outre son efficacité en tant qu’outil d’édition génétique, il est aujourd’hui utilisé pour améliorer les cultures, contrôler la transcription, induire des modifications épigénétiques (2) et détecter des virus (Zika et dengue à ce jour) avec une grande sensibilité et à faible coût (3), pour ne citer que quelques exemples. L’une des caractéristiques les plus intéressantes de ce système réside dans son application aux criblages. Cette technique implique l’utilisation de bibliothèques de molécules d’ARN uniques conçues pour cibler de nombreuses cibles (parfois plus de 150 000).(4) Elle a été appliquée pour inactiver systématiquement plus de 18 000 gènes individuels,(5,6) identifier de nouveaux gènes de fitness (gènes impliqués dans la croissance et la prolifération cellulaires),(4) ainsi que de nouvelles cibles pour l’immunothérapie contre le cancer.(7)

En ce qui concerne le cancer, la découverte de CRISPR a immédiatement suscité de grands espoirs sur le plan thérapeutique. Très peu d’essais cliniques ont été lancés à ce jour (ce qui est, il faut bien l’admettre, tout à fait normal pour une technique qui n’a que cinq ans), mais malgré l’enthousiasme général, les inquiétudes initiales concernant la spécificité du système et ses effets hors cible quelque peu imprévisibles ne sont toujours pas entièrement dissipées. Différentes études se sont attachées à identifier ces effets hors cible, notamment un rapport récent, très controversé et assez alarmiste (8), tandis que de nombreuses autres décrivent des améliorations apportées au système pour réduire ces effets secondaires indésirables (9–11). Ces efforts pourraient bientôt résoudre définitivement le problème des effets hors cible, mais nous n’en sommes pas encore tout à fait là.

Même si le système présente une spécificité parfaite, certains obstacles empêcheront CRISPR de devenir le système idéal pour certaines applications d’édition génétique, en raison précisément du mécanisme de réparation qu’il déclenche. En effet, une fois que l’enzyme CRISPR a coupé l’ADN, deux mécanismes de réparation différents peuvent être induits : la jonction des extrémités non homologues (NHEJ) entraîne de petites insertions ou délétions (indels) au niveau de la cassure double brin (DSB), tandis que la réparation dirigée par homologie (HDR) peut intégrer un ADN donneur exogène au niveau du site de coupure. Au grand dam des spécialistes de l’édition génétique, le NHEJ est largement prédominant après les coupures CRISPR, ce qui entraîne des indels plutôt imprévisibles, même lors de l’intégration d’un ADN donneur. Ces indels peuvent s’avérer utiles car ils peuvent induire un décalage de cadre, conduisant à une inactivation, mais ils représentent un problème majeur pour l’édition génétique de précision, en particulier pour les mutations ponctuelles ou les knock-ins de grande taille. Par conséquent, le génome de toute cellule, de tout clone ou de tout animal obtenu à l’aide de CRISPR doit être soigneusement séquencé afin de déterminer la mutation exacte qui a été introduite.

Les effets hors cible imprévisibles et les indels ne constituent peut-être pas un problème majeur lorsqu’on travaille avec des cellules, et il s’agit sans doute de la méthode la plus efficace pour modifier le génome de certaines espèces (les rats génétiquement modifiés font leur retour), mais lorsqu’on recherche une méthode fiable, robuste et précise pour créer une souris transgénique, la recombinaison homologue (HR) classique reste sans doute la solution la plus sûre, en particulier pour les knock-ins de grande taille. Aujourd’hui, il est indéniable que CRISPR est un système formidable et utile qui a rendu l’édition génétique plus facile, plus rapide et moins coûteuse. Mais ce n’est pas une solution miracle, et il doit encore être amélioré pour devenir l’outil d’édition génétique parfait, fiable et précis.

‍

Références :

1. Barrangou, R. et al. « CRISPR confère une résistance acquise aux virus chez les procaryotes ». Science 315 , 1709–1712 (2007).
2. Komor, A.C. et al. Technologies basées sur CRISPR pour la manipulation des génomes eucaryotes. Cell 168, 20–36 (2017).
3. Gootenberg, J.S. et al. Détection d'acides nucléiques à l'aide de CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356 , 438–442 (2017).
4. Hart, T. et al. Des criblages CRISPR à haute résolution mettent en évidence des gènes liés à la capacité d’adaptation et des prédispositions au cancer spécifiques à certains génotypes. Cell 163, 1515–1526 (2015).
5. Wang, T. et al. Criblage génétique dans des cellules humaines à l'aide du système CRISPR-Cas9. Science 343, 80–84 (2014).
6. Shalem, O. et al. Criblage à l'échelle du génome de gènes inactivés par CRISPR-Cas9 dans des cellules humaines. Science 343, 84–7 (2014).
7. Manguso, R.T. et al. Un criblage CRISPR in vivo identifie Ptpn2 comme cible pour l'immunothérapie anticancéreuse. Nature (2017). doi:10.1038/nature23270
8. Schaefer, K.A. et al. Mutations inattendues après une modification in vivo par CRISPR-Cas9. Nat. Methods 14, 547–548 (2017).
9. Ran, F.A. et al. Double coupure par le système CRISPR-Cas9 guidé par l'ARN pour une spécificité accrue de l'édition génomique. Cell 154, 1380–1389 (2013).
10. Mali, P. et al. Activateurs transcriptionnels CAS9 pour le criblage de la spécificité des cibles et nickases appariées pour l'ingénierie génomique coopérative. Nat. Biotechnol. 31, 833–8 (2013).
11. Fu, Y., et al. Amélioration de la spécificité des nucléases CRISPR-Cas grâce à l'utilisation d'ARN guides tronqués. Nat. Biotechnol. 32, 279–84 (2014).