IRES：内部リボソーム進入部位

共発現モデルおよび／またはレポーターモデルの構築

IRES（内部リボソーム進入部位）を利用することで、研究者は同一のプロモーターの制御下で複数の遺伝子を共発現させることができます。過去10年間で、IRESは数百もの遺伝子改変モデルの開発に活用されており、げっ歯類動物モデルにおけるトランスジーンの共発現において「定番」の技術と見なされています。

仕組みはどのようなものですか？

標的遺伝子の内因性プロモーターは、対象遺伝子（下図の青色部分）および蛍光レポーター遺伝子（下図の赤色部分）のコード領域を含む単一のmRNAの転写を制御する。レポーター遺伝子と対象遺伝子は、2つの独立したタンパク質（融合していない）として発現するため、最終的にレポータータンパク質は完全な機能を維持することができる。対象遺伝子の内因性発現は、可能な限り維持される。

IRES技術の応用

1) 多遺伝子に基づく疾患モデルの構築

IRESは、さまざまなヒトの病態を模倣するモデルの構築に有効に活用されてきた。同一のプロモーターの制御下で、複数のcDNAを発現させることができる。その結果、これらの遺伝子が同一の細胞や組織内で共発現することになる。

事例研究：アルツハイマー病の高度なマウスモデル

Ryan D、Koss D、Porcu E、Woodcock H、Robinson L、Platt B、Riedel G.「
PLB1トリプルノックインアルツハイマー病マウスにおける空間学習障害は、課題特異的かつ加齢依存的である。」
Cell Mol Life Sci. 2013.

Platt B、Drever B、Koss D、Stoppelkamp S、Jyoti A、Plano A、Utan A、Merrick G、Ryan D、Melis V、Wan H、Mingarelli M、 ポルク E、スクロッキ L、ウェルチ A、リーデル G.
新規ノックイン型アルツハイマー病マウス「PLB1」における認知機能、睡眠、脳波および脳代謝の異常。
PlosOne 2011.

PLB1遺伝子の構築体の設計と発現レベル

A)CaMKIIαプロモーター、ヒトAPP（hAPP）、内部リボソーム進入部位（IRES）、そしてTau（hTau）から構成されるトランスジェニック構築体のゲノム配列。変異部位も示されている。hAPPとhTauは、それぞれloxPサイトとFRTサイトに挟まれている。Neo：ネオマイシン選択カセット。

B)大脳皮質において測定された hAPP（左）および hTau（右）トランスジーンの mRNA 発現は、時間の経過とともに安定していた。ホモ接合体（homo）の動物では、ヘテロ接合体（het）のマウスと比較して、2～3倍高い発現レベルが認められた。

2) レポーターモデルの構築

IRESを利用することで、対象遺伝子の3’UTRにレポーター遺伝子を挿入することができます。活性化されると、IRES-レポーター-対象遺伝子からなる構築体を含むmRNAは、2つの独立したタンパク質として翻訳されます。

このレポーターにより、研究者は遺伝子発現レベルを定量化し、対象となる遺伝子を発現している細胞を追跡し、その遺伝子の制御状況をモニタリングすることが可能になります。 これまで、こうしたモデルは、例えば、制御性T細胞のエフェクター機能を定量化するため（以下の事例1を参照）、サイトカイン産生を定量化するため、サイトカイン産生細胞の経時的な変化を追跡するため、あるいは嗅覚ニューロンにおける特定の臭気受容体を可視化するためなどに構築されてきた（以下の事例2を参照）。

事例研究：ルシフェラーゼおよびmRFPレポーター

事例 1 | 造血幹細胞および急速に分裂する赤血球前駆細胞の生体内モニタリングのための IRES-ルシフェラーゼモデル

Alvarez S、Díaz M、Flach J、Rodríguez-Acebes S、López-Contreras AJ、Martínez D、Cañamero M、Fernández-Capetillo O、Isern J、Passegué E、Méndez J.「
」MCMの発現低下によって引き起こされる複製ストレスは、胎児の赤血球生成および造血幹細胞の機能を制限する。
Nat Commun. 2015.

Mcm3遺伝子の低発現型対立遺伝子を持つマウス系統。

A)マウスMcm3遺伝子の改変対立遺伝子を設計した。この対立遺伝子では、エクソン14～17の両側にloxPサイトが配置され、IRES要素の制御下にある3'UTRにルシフェラーゼレポーターが挿入されている。得られた対立遺伝子（Mcm3-lox）は、Creリコンビナーゼを用いてMcm3の発現を阻害できることから、コンディショナル として設計された。

B)Mcm3-loxの発現は、ルシフェラーゼの発現に伴う生物発光活性によってモニタリングすることができた。

事例 2 | 制御性T細胞の活性をモニタリングするためのFoxp3-IRES-mRFP（FIR）レポーターマウスモデル

Dioszeghy V、Mondoulet L、Dhelft V、Ligouis M、Puteaux E、Dupont C、Benhamou PH.
経皮免疫療法による制御性T細胞の誘導は持続的であり、ピーナッツ感作マウスにおける好酸球性疾患からの長期的な防御をもたらす。
Clin Exp Allergy. 2014.

Wan YY、Flavell RA.
バイシストロン型レポーターを用いたFoxp3発現抑制性T細胞の同定。
Proc Natl Acad Sci USA. 2005.

図1. マウスFoxp3遺伝子座へのIRES-mRFPレポーターの導入。

A)マウスFoxp3遺伝子座、ターゲティングDNA構築体、およびターゲティングされたFoxp3遺伝子座の地図。 Foxp3 遺伝子のエクソン 13 を含む 11 kb のマウスゲノム DNA を、BstZ17I (B) および HpaI (H) を用いて切り出し（図 1、上）、pEasy-Flox ベクターのチミジンキナーゼ (TK) 選択マーカーの隣にクローニングした。 IRES-mRFP および loxP で挟まれたネオマイシン (Neo) 選択マーカーを含むカセットを、Foxp3 遺伝子の翻訳停止コドン (UGA) とポリアデニル化シグナル (_A2UA3) の間の SspI (S) サイトに挿入した（中央）。 正しく標的化されたES細胞を用いて、キメラおよび生殖系列伝達マウスを作出しました。Creリコンビナーゼをトランスジェニックに発現するデレーターマウスを使用し、生体内でNeo遺伝子を除去することで、Foxp3遺伝子座が標的化されたマウスを作出しました（下図）。

B)FIRマウスのPCRによる遺伝子型判定。FIRマウスの遺伝子型判定のために、3つのプライマー（P1～P3）が設計された。PCRの結果、野生型（wt）Foxp3対立遺伝子では517 bpの産物が、標的化Foxp3対立遺伝子では470 bpの産物が得られた。

図2. mRFPの発現は、Foxp3を発現するCD4 T細胞を、その制御活性を損なうことなく正確に標識しており、さまざまなリンパ球コンパートメントにおいてFoxp3の発現が検出された。

FIRマウスから末梢リンパ球を採取し、蛍光色素標識された抗CD4抗体および抗CD25抗体で染色した。CD4 T細胞におけるmRFPの発現をフローサイトメトリーにより測定した（左）。FACSを用いてFIRマウスから精製した末梢CD4 T細胞の各集団（図示の通り）からRNAを抽出した。 Foxp3の相対mRNAレベルはTaqManリアルタイム定量PCRにより測定し、2回の実験結果を統合してプロットした。

3) 細胞系譜追跡モデルの構築

対象遺伝子の3'UTRにIRESを挿入することで、細胞系統追跡のためのモデルを構築することが可能になります。研究者らは、これらのモデルを用いて、特定の細胞集団の時空間的な細胞運命を調査・分析することができます。

事例研究：腸上皮の系譜追跡実験

Barker N、van Es JH、Kuipers J、Kujala P、van den Born M、Cozijnsen M、Haegebarth A、Korving J、Begthel H、Peters PJ、Clevers H.「
マーカー遺伝子Lgr5による小腸および結腸の幹細胞の同定」。
『Nature』2007年。

図1. Lgr5遺伝子の第1エクソンへの遺伝子ノックインにより、単一のバイシストロンmRNAからEGFPおよびCre-ERt2を発現するマウスの作製。

図2. 小腸および大腸における系譜追跡。

A)Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2ノックインマウスとRosa26-lacZレポーターマウスを交配し、TAM投与から12時間後の状態。

B) 挿入図の図式に従い、クリプト底面に対する特定の位置に青い細胞が現れた頻度 。Cre1 LacZで標識されたクリプト基底柱状細胞（CBC）の大部分はパネト細胞間の位置に存在したが、これらの細胞のうち、パネト細胞の真上にある「14」の位置で観察されたのはわずか10％であった（青線）。 放射線照射後の成体マウスにおいて、長期にわたりDNA標識を維持する細胞（「14」と標識された腸幹細胞）の位置に関する定量データが最近発表された（Potten et al. J. Cell Sci. 2002）。このグラフは、これらのデータ（赤線）と、活性化Creを保有するCBC細胞の位置との比較を示している。

C-E)誘導後1日（C）、5日（D）、および60日（E）における小腸のLacZ活性の組織学的解析。

F-H)ラクトース結合酵素（LacZ）で染色した腸管をペルイディック酸・シッフ（PAS）法で二重染色したところ、誘導された青色クローン内に杯細胞（F、白い矢印）およびパネート細胞（G、青い矢印）の存在が確認された。シナプトフィシンによる二重染色により、誘導された青色クローン内に腸内分泌細胞が存在することが示された（H、黒い矢印）。

I-K)誘導後1日（I）、5日（J）、および60日（K）における結腸のLacZ活性の組織学的解析。

4) KOモデルにおける細胞の発現パターンのモニタリング

IRESシステムは、KOMP、EUCOMM、NorCOMMといったハイスループットノックアウトコンソーシアムによって開発されたコンディショナル マウスモデルで広く利用されています。

これらのシステムにより、研究者はさまざまな組織や細胞における遺伝子発現パターンや遺伝子制御を観察することができる。

生体内研究用の即利用可能なノックアウトモデル

genOwayは、EUCOMMが提供する10,000以上の即利用可能なマウスモデルへのアクセスを提供しています。そのうち、1,200の表現型が同定された系統は、免疫学・炎症、免疫腫瘍学、代謝、神経科学、疼痛、ならびに心血管系および筋骨格系に関連するヒト疾患と関連付けられています。

genOwayで利用可能なモデルの中に、お気に入りの遺伝子が含まれているかどうかを確認してください。

EUCOMMのベクトルマップの例：

5) 組織特異的Creドライバー系統の作製

IRESは、ノックインCreドライバー系統の作製によく用いられます。ノックイン法を用いることで、ドライバー系統は、選択されたCre発現座発現パターンを忠実に再現することができます。

IRES配列は、標的遺伝子の発現を維持するか、あるいはレポーター遺伝子の共発現を可能にする。このレポーターは、発現レベルやCreリコンビナーゼの発現パターンに関する情報を提供することができる。

事例研究：ニューロンにおける標的再組み換え、およびHDC-Creを用いた選択的標的化

事例 1 | PrRP ニューロンにおける標的再組み換えの実証

Dodd GT、Worth AA、Nunn N、Korpal AK、Bechtold DA、Allison MB、Myers MG Jr、Statnick MA、Luckman SM。
レプチンの熱産生効果は、視床下部背内側部に存在するプロラクチン放出ペプチド神経細胞の特定の集団に依存している。
Cell Metab. 2014.

Creリコンビナーゼは、PrRPニューロンにのみ発現する

PrRP-cre::eGFPマウスの背内側視床下部核（DMH）、孤束核（NTS）、および腹外側延髄（VLM）における、PrRP（青）とeGFP（赤）の二重免疫染色、ならびに内因性eGFP蛍光（緑）を示す。

事例 2 | HDC-Cre マウスを用いた細胞種特異的な遺伝子標的化

Zecharia AY、Yu X、Götz T、Ye Z、Carr DR、Wulff P、Bettler B、Vyssotski AL、Brickley SG、Franks NP、Wisden W.
GABA作動性神経によるヒスタミン作動性ニューロンの抑制は、覚醒状態を調節するが、睡眠・覚醒の切り替えやPPFによる意識喪失は調節しない。
J Neurosci. 2012.

HDC-Creノックインマウス系統を作出するための遺伝子ターゲティング戦略。

IRES-Creカセットは、hdc遺伝子のエクソン12、終止（TAG）コドンとポリアデニル化（pA）シグナルの間に配置した。ES細胞における陽性選択を行うため、FRTで挟まれたネオマイシン耐性遺伝子をその下流に挿入した。 ネガティブセレクションには、3'同源アームを挟むように配置されたGFP発現遺伝子を用い、蛍光を発しないコロニーを解析した。ターゲティングに成功した後、FLPリコンビナーゼを用いてネオマイシンカセット（Neo）を除去し、最終的なターゲティングされた対立遺伝子を得た。