CRISPR/Cas9による遺伝子編集

CRISPR/Cas9：構造、作用機序、有効性、オフターゲット活性、遺伝的背景、マルチターゲティング、点変異、および大規模欠失。

CRISPR/Cas9の構造と作用機序

CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステムには、標的配列を切断するCas酵素と、20塩基対（bp）の標的配列に結合するシングルガイドRNA（sgRNA）という2つの構成要素が必要です。標的配列（sgRNA配列と相補的）の直後には2つのシトシンヌクレオチドが続きます。これは、対向するDNA鎖が任意のヌクレオチドに続いて2つのグアニン（-NGG）で構成されている場合に、sgRNAが最も強く結合するためです。この配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列と呼ばれます。PAMは、Cas9の由来によって異なります。

CRISPR/Cas9は、標的部位に特異的な二本鎖切断を生成し、それによってDNA修復メカニズムが引き起こされます。こうした修復の結果、2種類のゲノム改変が生じます。すなわち、非相同末端結合による恒常的なノックアウト（KO）と、相同組換えによるノックイン（KI）です。

CRISPR/Cas9システムは、標的配列の下流に短いPAM配列を必要とする、単純な単一塩基対形成による認識システムです。
カスタマイズされたCRISPR/Cas9ヌクレアーゼの設計は、他のヌクレアーゼ（TALENやZNFなど）と比較して最も簡単です。

公表されているデータおよび当社の内部データ（以下の段落を参照）は、配列構成が、生体内におけるCRISPR/Cas9の作用の有効性および特異性を決定する上で重要な要因であることを明確に示しています。

CRISPR/Cas9の有効性

設計が単純であるからといって、高い有効性が保証されるわけではない。文献によれば、真核細胞や齧歯類において、標的配列ごとに有効性に大きなばらつきが見られることが示されています。

2013年以来、genOwayは高い有効性を実現するため、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの設計およびプロトコルの最適化に多大な投資を行ってきました。その際、以下のパラメータが極めて重要でした：

ゲノム領域の構造
オフターゲット効果の予測が低い
注射プロトコル

図1. CRISPR/Cas9の切断効率
齧歯類または細胞系における97種類の異なるCRISPR/Cas9デザインの効率について記述した20編の査読済み論文（参考文献4～23）のデータをまとめ、88種類の異なるCRISPR/Cas9デザインについて我々が得た未発表データと比較した。

結果：

CRISPR/Cas9の設計のうち、69％で高い切断効率を達成した。

一部のCRISPR/Cas9ヌクレアーゼは、活性が非常に低く、場合によってはほとんど検出できないほどです。この技術の品質や性能は高いかもしれませんが、過大に宣伝したり過大評価したりすべきではありません。この技術は、まだ完全に信頼できるものではありません。
genOwayは、CRISPR/Cas9の高い有効性を実現するため、配列設計の最適化と導入プロトコルの改善を行いました。

CRISPR/Cas9のオフターゲット活性

このヌクレアーゼ技術の大きな欠点の一つは、ゲノム配列の非特異的（オフターゲット）切断です。ゲノムに生じるこのような「追加的な」変異は、作製されたモデルの表現型に大きな影響を及ぼす可能性があります。

トランスジェニック動物（ランダム挿入）については、遺伝子改変と観察された表現型との関連性を統計的に実証するため、複数の独立した変異動物系統を解析することが強く推奨されます。

CRISPR/Cas9によるオフターゲット現象は、以下の2つの異なる分子メカニズムによって説明することができます：

Cas9ヌクレアーゼは特定の配列を標的としますが、それとはわずかに異なる配列（縮退配列）も認識され、切断されることがあります。このようなオフターゲットのメカニズムは、縮退した標的配列のシーケンシングを行うことで解明することができます。
Cas9ヌクレアーゼはゲノム内でランダムに切断する可能性があります：その分子メカニズムが提唱されています。このメカニズムでは、ヌクレアーゼ複合体がDNAをスキャンして特定の配列を探している際に、ランダムな切断が生じることがあります。このオフターゲット活性は、全ゲノムシーケンシングによってのみ測定可能です。

ZFNやTALENについては、高いオフターゲット活性が確認されています。CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステムもオフターゲット効果を引き起こすが、その頻度はZFNやTALENよりも低い。しかし、この違いが統計的に有意であるかどうかを判断するには、まだ時期尚早です。

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図2.
CRISPR/Cas9のオフターゲット現象の定量化については、最近の18編の論文で報告されている。（参考文献 5、7～10、13～17、19、20、22、24～27）

結果：

オフターゲット効果が存在し、その影響が極めて甚大になり得ることが明確に示されている。

genOwayが開発したすべてのモデルは、オフターゲット活性を最小限に抑えるよう体系的に検証されています。当社のCRISPR/Cas9ヌクレアーゼの設計は、オフターゲット効果を最小限に抑えるよう厳格に行われています（後述の「genOwayの進行中の研究開発プログラム」を参照）。

CRISPR/Cas9ヌクレアーゼに使用された遺伝的背景

ほとんどの実験室では、実験にアウトブレッド系統やハイブリッド系統のマウス（FVB、B6D2など）を使用しています。これは、これらの系統が安定した実験条件（胚数の増加、注入後の生存率の高さ、胚1個あたりの出生数増加など）を提供するためです。

とはいえ、近交系を背景とする遺伝子改変モデルは、通常、科学的な価値が高い。genOway社は、C57BL6の遺伝的背景を用いてCRISPR/Cas9プラットフォームを開発しました。

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図3.
これまでに発表された11種類のCRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステムがC57BL6胚を用いて検証された（参考文献14、15、21、23、28～31）。一方、genOwayは、C57BL6胚を用いて検証され、有効性が確認された97種類の設計について、累積的な実績を有している。

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genOway社は、この脆弱な遺伝的背景に対応したプロトコルや手順を用いて、C57BL6の遺伝的背景にCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ技術を適用する豊富な経験を有しています。

ラットモデルについては、genOwayはSprague-Dawley（SD）を用いた標準的なサービス体制を構築しています。その他の遺伝的背景については、現在開発中です。

構成的ノックアウトモデル：CRISPR/Cas9ヌクレアーゼによって作製された変異タイプ

ヌクレアーゼを用いたKOモデルの作製は、標的配列に変異を誘導するNHEJ（非相同末端結合）メカニズムに基づいています。

図4.
CRISPR/Cas9ヌクレアーゼによって誘発される変異のほとんどは、小さな変異である。

我々は、C57BL6受精卵にCas9を注入して生成した121個の変異体において、10種類の異なるCRISPR/Cas9デザインによって生じた変異の種類を体系的に解析した。
黒い縦線は切断部位を示す。
灰色の点は欠失、緑色の点は挿入、青色の点はミスマッチを示す。

結果：

全変異の76％は、12塩基対（bp）未満の小さな変異である（そのうち68％が小さな欠失、8％が小さな挿入）。

CRISPR/Cas9ヌクレアーゼは、標的配列内に微小な変異を生成します。これらの微小な変異により、TALENやZFNを用いる場合よりも、より信頼性の高い恒常的ノックアウト（KO）モデルの開発（設計および作製）が可能となります。

ノッキンモデル：CRISPR/Cas9ヌクレアーゼによって生成される変異タイプ

ヌクレアーゼを用いてノックイン（KI）モデルを作成することは、主要な目標の一つである。科学界は、以下の2つの特別な課題に直面している：

KIモデルの設計には、正確な挿入位置の決定が求められます。そのため、ターゲット配列の設計の自由度は制限されます。
ヌクレアーゼを介した相同組換えは、ヌクレアーゼを介した突然変異に比べて発生頻度がはるかに低い。したがって、ヌクレアーゼの効力は高くなければならない。

それにもかかわらず、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼを用いて、小さなDNA断片やトランスジーンを用いたKIを作成することで、すでに非常に有望な結果が得られている（参考文献25；genOwayの結果、図5a、bおよび8a、b）。

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図5a. LoxP部位を含む小さなDNA断片を用いたCRISPR/Cas9 ノックイン戦略（背景：C57BL6）A)LoxP部位を有する内因性遺伝子座および消化部位を有する組換え遺伝子座の説明。B)PCRおよびその後の消化による相同組換え（HR）事象の検出。C)PCR産物をシーケンシングし、HRによるノックインを確認した。D)実験データ。

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図5b. 点変異を有する単鎖オリゴヌクレオチドを用いたCRISPR/Cas9ノックイン 戦略（背景系統：C57BL6）A)内因性遺伝子座および組換え遺伝子座の説明。B)ノックイン事象を同定するために、PCR産物のシーケンシングを行った。C)実験データ。

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図6a、b。
：CRISPR/Cas9を用いた2つのサイトカイン遺伝子へのトランスジーン挿入（背景系統：C57BL6）

genOwayが現在進めている研究開発プログラム

a) CRISPR/Cas9を用いたマルチターゲティングモデル

CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ技術を用いれば、マルチターゲティング（同一の胚または細胞内で複数の標的を改変すること）が可能である。
文献では、マウス（参考文献 7、14、25）、ラット（参考文献 20、22）、および細胞（参考文献 4）において、2～5個の遺伝子を同時に標的とした事例が報告されている。
成功率はさまざまであり、各CRISPR/Cas9の有効性に依存する。

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図7.
genOway社は、マウスゲノム内の複数の部位を効率的に標的とするプロトコルの検証を行ってきました。当社の経験によれば、重要なパラメータは、使用するCRISPR/Cas9の相対的な有効性です。

b) CRISPR/Cas9を用いた大規模な欠失

図8.2つのCRISPR/Cas9を用いた
のゲノム欠失（背景：C57BL6）

A)内因性および欠失した遺伝子座の説明。
B)欠失は、欠失対象となる配列をカバーするプライマーを用いて検出された（野生型：1261 bp、欠失型：731 bp）。PCR産物のシーケンシングを行い、欠失を確認した。9つのサンプルのうち、サンプル2および6のみに予想通りの欠失が認められた。

削除されるデータは、予想されるサイズのものから、それより小さいものがいくつかあるものまでさまざまです。

現在、最大5 kbの長さの遺伝子配列を効率的かつ確実に削除するためのプロトコルを開発中です。

c) CRISPR/Cas9のオフターゲット効果

当機関では、オフターゲット効果に焦点を当てた複数のプログラムを現在実施しています：

標的配列に類似した配列（縮退配列）や、無関係な配列（ランダム切断）に対するオフターゲット効果を効率的に検出するための手順およびプロトコルを策定する。
1）CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの設計に関するより厳格なルールを適用し、2）ヌクレアーゼ活性を低減させるよう注入プロトコル（品質および持続時間）を最適化することで、オフターゲット活性を低減する。

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CRISPR-Cas9の特許：混同しないように！

どうしてそうしないの？
だって、基礎となる特許ポートフォリオはたったの3つしかないんだから！

顧客を侵害リスクから守るため、genOwayは3つのポートフォリオすべてについてライセンスを取得するために多額の投資を行いました。

したがって：

当社のお客様は、第三者から追加のライセンスを取得することなく、研究開発（社内または商用）のためにCRISPR-Cas9モデルを使用することができます。
サードパーティの提供元から入手したげっ歯類モデルの社内開発または利用については、genOwayから承認を取得することができます。

^{特許が1件付与されるごとに、色付きの点が1つ表示されます。}

真核生物分野における3つの基幹特許ポートフォリオは、以下の企業によるものです：

シグマ・アルドリッチ（別名メルク）は、標的DNAを改変して二本鎖切断を引き起こすあらゆるCRISPR-Cas9システムを網羅している（このシステムは、ノックインを行うために外因性配列と組み合わされる場合がある）。
バークレーは、標的配列を改変するためのあらゆるCRISPR-Cas9システムと、少なくとも1つのガイドRNAを対象としている。
Broadは、標的配列を改変するためのあらゆるCRISPR-Cas9システムを対象としており、そのCRISPRシステムはベクターの形で細胞に導入されるものである。