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Études de cas

Ce modèle permet au chercheur de quantifier le niveau d’expression d’un gène, de suivre les cellules exprimant le gène d’intérêt et de surveiller la régulation de ce gène. Par le passé, de tels modèles ont notamment été développés pour quantifier la fonction effectrice des lymphocytes T régulateurs (cas n° 2), pour quantifier la production de cytokines, pour suivre dans le temps les cellules productrices de cytokines ou encore pour surveiller les progéniteurs érythroïdes en division rapide (cas n° 1).

Dans ces deux modèles, on utilise l'IRES pour insérer le gène rapporteur dans la région 3' UTR du gène d'intérêt. Une fois activé, l'ARNm constitué du construct IRES-gène rapporteur-gène cible est traduit en deux protéines indépendantes.

Cas n° 1 | Modèle IRES-luciférase pour le suivi in vivo des cellules souches hématopoïétiques et des précurseurs érythrocytaires à division rapide (créé par genOway)

Alvarez S, Díaz M, Flach J, Rodriguez-Acebes S, López-Contreras AJ, Martínez D, Cañamero M, Fernández-Capetillo O, Isern J, Passegué E, Méndez J.
Le stress de réplication provoqué par une faible expression de MCM limite l'érythropoïèse fœtale et la fonctionnalité des cellules souches hématopoïétiques.
Nat Commun. 2015.

Souche de souris porteuse d'un allèle hypomorphe du gène Mcm3.

A) Un allèle Mcm3 de souris modifié a été conçu avec des sites loxP flanquant les exons 14 à 17 et un gène rapporteur luciférase inséré dans la région 3' UTR sous le contrôle d'un élément IRES. L'allèle ainsi obtenu (Mcm3-lox) était destiné à servir de KO conditionnel, l'expression de Mcm3 pouvant être supprimée à l'aide de la recombinase Cre.

B) L'expression de Mcm3-lox pouvait être suivie grâce à l'activité bioluminescente liée à l'expression de la luciférase.

Cas n° 2 | Modèle murin rapporteur Foxp3-IRES-mRFP (FIR) permettant de suivre l'activité des lymphocytes T régulateurs

Dioszeghy V, Mondoulet L, Dhelft V, Ligouis M, Puteaux E, Dupont C, Benhamou PH.
L'induction de cellules T régulatrices par l'immunothérapie épicutanée est durable et assure une protection à long terme contre les troubles éosinophiles chez les souris sensibilisées à l'arachide.
Clin Exp Allergy. 2014.

Wan YY, Flavell RA.
Identification des lymphocytes T suppresseurs exprimant Foxp3 à l'aide d'un rapporteur bicistronique.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2005.

Figure 1. Intégration du rapporteur IRES-mRFP dans le locus Foxp3 de la souris.

A) Cartes du locus Foxp3 chez la souris, de la construction d’ADN ciblée et du locus Foxp3 ciblé. Un fragment d’ADN génomique de souris de 11 kb, comprenant l’exon 13 du gène Foxp3, a été excisé à l’aide des enzymes BstZ17I (B) et HpaI (H) (en haut), puis cloné dans le vecteur pEasy-Flox à proximité du marqueur de sélection thymidine kinase (TK). Une cassette contenant l’IRES-mRFP et le marqueur de sélection néomycine (Neo) flanqué de loxP a été insérée dans un site SspI (S) situé entre le codon d’arrêt de traduction (UGA) et le signal de polyadénylation (_A2UA3) du gène Foxp3 (au milieu). Une cellule ES correctement ciblée a été utilisée pour créer des chimères et des souris à transmission germinale. Le gène Neo a été supprimé in vivo à l’aide de souris délétantes transgéniques pour la recombinase Cre afin de générer des souris porteuses du locus Foxp3 ciblé (en bas).

B) Génotypage par PCR des souris FIR. Trois amorces (P1 à P3, comme indiqué) ont été conçues pour le génotypage des souris FIR. La PCR a permis d'obtenir un produit de 517 pb pour l'allèle Foxp3 de type sauvage (wt) et un produit de 470 pb pour l'allèle Foxp3 ciblé.

Figure 2. L'expression de mRFP permet de marquer fidèlement les lymphocytes T CD4 exprimant Foxp3 sans compromettre leur activité régulatrice, et l'expression de Foxp3 a été détectée dans différents compartiments lymphocytaires.

Des lymphocytes périphériques provenant de souris FIR ont été prélevés et marqués à l'aide d'anticorps anti-CD4 et anti-CD25 conjugués à des fluorophores. L'expression de la mRFP dans les lymphocytes T CD4 a été évaluée par cytométrie en flux (à gauche). L'ARN a été extrait de différentes populations de lymphocytes T CD4 périphériques (comme indiqué), purifiées à partir de souris FIR par FACS. Les niveaux relatifs d'ARNm de Foxp3 ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel TaqMan, et les résultats combinés de deux expériences ont été représentés graphiquement.