in vitroモデルの改善：オルガノイドの成熟期

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2018年3月13日

生物学やその他の科学分野における実験研究について、その手法や仕組みを少しでも知れば、すべてが「モデル」にかかっていることがすぐに明らかになります。例えば、生物医学研究において、全体的な目的は、人体や人体に影響を及ぼす疾患をより深く理解し、それらの発生や進行メカニズムを解明することで、予防や治療につなげることです。そのため、モデルの妥当性という問題が極めて早く核心的な課題となります。すなわち、 in vivo 研究にはどの生物を用いるべきか？　in vitro実験にはどの細胞系を用いるべきか？　したがって、私たち研究コミュニティは、患者の体内で起きていることを再現するための最善の方法を常に模索し、「完璧な」モデルを探し求めているのです。

in vitroモデルは、これまで一貫して生物医学研究の中心的な役割を果たしてきましたが、その利用は今後さらに拡大していくと言えるでしょう。in vitroモデルは、関与する細胞の種類、必要な材料、システムの複雑さ、さらにはその外観などによって、その種類は枚挙にいとまがない。歴史的に、in vitro研究は「シャーレ内の細胞」を単層または懸濁液として用いることから始まり、これは現在「2Dシステム」と呼ばれているが、現在では「3Dシステム」と呼ばれるように、1次元を追加することで細胞を複雑な構造の中で培養する多くの方法が存在する。過去50年ほどの間、ある臓器から細胞を採取し、それらを分散させてから（適切な条件下で――ここがポイントだ！）、培養皿内で再び集めてやれば、それらは再編成され、元の臓器を（規模は小さく、構造は単純化された形ではあるが）再形成できることが知られている。自己組織化の性質を持つこれらの「ミニ臓器」、すなわちオルガノイドは、ニワトリの胚組織に関する、今や「古典的」とされる研究(1)で初めて観察されましたが、実際にはほぼすべての脊椎動物の発達中の臓器に存在することが示されています。

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オルガノイドとは、今日では、幹細胞から発生し、細胞の選別と空間的に制限された分化決定を通じて自己組織化する3次元構造と定義されている。言い換えれば、これらの構造は細胞間の「認識」を通じて形成され、空間的な制約によって3次元的に組織化される一方で、幹細胞はさまざまな分化決定済みの細胞タイプを生み出す。 2009年の画期的な論文において、ハンス・クレヴァースらは、腸上皮幹細胞のみを用いて、陰窩や平らな絨毛を備えた「ミニ腸」をin vitroで再現できることを示した(2)。これらの腸オルガノイドでは、多能性細胞が、in vivoと同様に、腸のすべての上皮細胞、すなわち吸収細胞や分泌細胞へと分化することができる。 in vivo、数ヶ月、場合によっては数年にもわたって培養を維持することができる。オルガノイドは、多能性幹細胞（PSC：胚性または誘導性）や臓器特異的な成体幹細胞（aSC）から形成することができ、現在では、腸から脳に至る10以上の臓器のモデルとして、臓器に応じてPSCおよび／またはaSCを用いて利用されています。興味深いことに、腫瘍からも形成することが可能です。

オルガノイドは、登場当初は主に発生生物学の研究、とりわけ器官形成の研究に用いられていたが、ここ10年ほどの間に、生物学の他の多くの分野でも再び注目を集め、さまざまな応用が可能な強力なモデルとして認識されるようになってきた。（『Nature Methods』誌により、「2017年の最優秀手法（Method of the Year 2017）」に選出されたばかりである。）(3) 例えば、がん研究において、オルガノイド、あるいはむしろ「トゥモーロイド」は、前がん性細胞を培養下で維持することが可能であるため、臨床的腫瘍サンプルを保存するための予想外の手法となっている。実際、2016年7月に「ヒトがんモデル・イニシアチブ（Human Cancer Model Initiative）」は、がんモデルの「バンク」にトゥモーロイドを含めることを発表した。(4) がんのサブタイプの多様性をより的確に捉えるため、さまざまな国の研究機関がこの取り組みに参加しており、これらのモデルは科学界全体と共有される予定である。重要な点として、培養下でがん細胞を維持することは、それらが増殖し続けていることを意味し、より詳細な分析に利用できる材料の量を大幅に増やすことになる。最近、研究者らはオルガノイドを用いて3種類の原発性肝がんの細胞を増殖させ、遺伝子発現解析を行い、希少ながんサブタイプのバイオマーカー発見への道を開いた。(5) オルガノイドは創薬分野でも活用されており、極めて決定的な成果が得られている。2017年5月、FDAは嚢胞性線維症治療薬「カリデコ（Kalydeco）」の適応症を、CFTR遺伝子の変異対象を10種類から33種類へと拡大した。(6) この決定は、患者由来の腸管オルガノイドを用いたin vitro試験のみに基づいており、オルガノイドの有望な前臨床的潜在能力を明確に実証するものである。

応用可能性のリストは、個別化医療、疾患モデリング、宿主と微生物の相互作用など、枚挙にいとまがないが、オルガノイドには依然としていくつかの欠点がある。場合によっては、オルガノイドにすべての細胞種が含まれていないことや、その構造が in vivo の臓器とは一致しない、あるいは機能が未熟であるといった問題が見られる。より複雑な設定を必要とする一部の応用分野や研究においては、これらのモデルは、オルガノイド・オン・チップや3Dバイオプリンティングといった、より精巧な3Dシステムにまもなくその性能で凌駕される可能性がある。どのモデルが「最良かつ最も適切なモデル」として評価されるかは、現時点ではまだ判断が難しいが、興味深いことに、技術や手法（2D、オルガノイド、オルガン・オン・チップ）であることに加え、どのモデルが最良と見なされるかは、そのプラットフォームで使用される細胞の選択にも左右されるという点である。究極の目標は、もちろんヒトの初代細胞の使用ですが、それらが常に利用可能とは限りません（神経細胞は明らかに大きな問題です）。そのため、代替手段として、ヒト誘導多能性幹細胞（hiPS細胞）由来の細胞や、齧歯類モデル由来の初代細胞が特に注目されています。たとえhiPS細胞由来の細胞にはある程度の未熟さが認められ、齧歯類の初代細胞が、まあ、ヒト由来ではないとしてもです。

つまり、確かに、現在のところ、in vitro研究において「最良かつ最も適切なモデル」というものは存在せず、用途によって異なるため、今後も単一のモデルが存在することはないかもしれません。

参考文献：

Weiss, P. & Taylor, A. C. 「分化が進んだニワトリ胚の単一細胞懸濁液からの完全な臓器の再構成」。Proc. Natl. Acad. Sci. 46, 1177–1185 (1960)。
Sato, T.et al.単一のLgr5幹細胞は、間葉系ニッチなしでもin vitroで陰窩・絨毛構造を形成する。Nature 459, 262–265 (2009).
「2017年の最優秀手法：オルガノイド」。『Nature Methods』15, 1 (2018)。
Ledford, H. 1,000の新たながんモデルを募集する世界的なイニシアチブ。doi: 10.1038/nature.2016.20242
Broutier, L.et al.疾患モデル化および薬剤スクリーニングのためのヒト原発性肝がん由来オルガノイド培養。Nat. Med. 23, 1424–1435 (2017).
Ratner, M. FDAは、嚢胞性線維症治療薬の適応拡大について、変異に関するin vitroデータが十分であると判断した。『Nature Biotechnology』35, 606 (2017).