PD-L1/PD-1シグナル伝達経路を調節する有望な新規低分子化合物群

新規低分子阻害剤によるPD-1/PD-L1阻害の治療的標的化は、固形腫瘍の微小環境へ細胞傷害性T細胞を動員する

Rita C Acúrcio ほか.J Immunother Cancer.2022年7月‍

免疫チェックポイント療法は、がん治療に革命をもたらしました。プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）またはPDリガンド1（PD-L1）を阻害することで、さまざまなヒトのがんにおいて有望な臨床成績が示されています。しかし、PD-1軸を標的とした免疫チェックポイント阻害療法として承認されているのはモノクローナル抗体のみであり、こうした広範囲にわたる治療は、多くの人々にとって経済的に手の届かないものとなっています。 『Journal for Immunotherapy of Cancer』誌に掲載された研究において、Rita C. Acurcio氏らは、腫瘍微小環境へのエフェクターCD8 T細胞の広範な浸潤を促進する、PD-L1/PD-1シグナル伝達経路の新規調節因子を同定した。

モノクローナル抗体（mAb）に反応を示す患者には多大な臨床的利益が認められる一方で、この免疫チェックポイント経路を調節するメカニズムの解明が進んでいないため、奏効率の低さ、長期寛解の欠如、重篤な免疫関連有害事象（IRAE）が生じており、これらが相まってmAbの製造コストを極めて高騰させている。 本研究において、Rita C. Acurcioらは、PD-L1またはPD-1を治療標的とする代替アプローチとして、低分子阻害剤の同定と検証に焦点を当てた。低分子化合物は、経口投与による生物学的利用能や生物学的有効性の向上、および半減期の短い作用をもたらすことが可能であり、これは特にIRAEの観点から重要である。

PD-1/PD-L1低分子阻害剤のインシリコ同定

著者らは、低分子阻害剤候補を同定するための計算機主導型アプローチの開発から始まるトランスレーショナル戦略を採用した。米国国立がん研究所（NCI）、エナミン（Enamine）、スペックス（Specs）、Mu.Ta.Lig Chemoteca、MMVなどの合成化合物ライブラリおよび社内データベースから、約90万種類の化合物をスクリーニングした。PD-L1結合部位への分子ドッキングを用いた、構造ベースの仮想スクリーニングを実施した。 その後、上位にランクインした化合物について徹底的なドッキング解析を行い、対応する結合姿勢および受容体結合ポケット内での相互作用をより高精度で予測した。最後に、選定された化合物群に対し、薬物様性を高めるためのリピンスキーの「5つのルール」を適用して選別を行い、受容体との結合コンフォメーションおよび表面の相補性が良好であり、かつポケット内の主要な残基との重要な相互作用を示す化合物のみを残した。

このアプローチにより、化学構造の多様な95種類のPD-L1結合候補が同定された。

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PD-1/PD-L1の相互作用を阻害するためのin vitro機能アッセイ

The authors tested them afterward for their capacity to inhibit the PD-1/PD-L1 interaction using in vitro functional assays with homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF). The results show that out of the 95 compounds tested, 16 (17%) chemically diverse compounds were able to lead to a 50% reduction of the HTRF signal, thus indicating a significant effect on the PD-1/PD-L1 inhibition (p<0.001). Among the 16 compounds, 12 revealed dose-response effect and were further analyzed for their ability to bind to PD-L1.

PD-L1の熱安定性を向上させる化合物の選定

著者らはその根拠について、検証済みのヒット化合物がBMS社製阻害剤と同様にPD-L1に結合すると予想していた。この仮説を検証するため、著者らは差分走査蛍光法（DSF）を用いた熱変性アッセイによりPD-L1の熱転移を測定し、PD-L1阻害剤候補の存在下でタンパク質のTmにシフトが生じるかどうかを調べた。 注目すべきは、すべての分子において熱的シフトが観察されたことである。最も有望な低分子阻害剤は化合物69であり、これについては（DSFで観察された安定化効果を確認するために）WaterLOGSY NMR実験が実施された。

ヒット化合物が細胞生存率に及ぼす影響およびPD-1/PD-L1相互作用の調節

そこで著者らは、PD-L1を自然発現する細胞に基づく2Dおよび3Dモデルを活用し、これらの化合物の活性をさらに評価することにした。in vitro試験を行うため、2種類のヒトがん細胞株（乳がんMDA-MB-231および黒色腫A375）が選択された。著者らは、PD-L1に結合するこれらの低分子化合物が、両がん細胞株においてPD-L1の発現レベルに著しい影響を与えることを確認した。

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化合物69の最終的な役割をさらに解明するため、研究者らは、患者由来の腫瘍細胞と末梢血単核細胞（PBMC）をペアで組み合わせた2次元および3次元の共培養実験を行い、最も有望なPD-1/PD-L1阻害剤で処理したサンプルが、この経路を阻害することでT細胞を活性化できることを明らかにした。

エク・ヴィヴォおよび in vivo T細胞の浸潤促進（ex vivoおよびin vivo）

さらに、3DメラノーマスフェロイドとPBMCの共培養により、低分子化合物がT細胞の浸潤を促進する能力があることが示された。

最後に、ex vivoでの知見の臨床的意義を広げるため、著者らはヒトに関連するin vivo を用いてこの低分子阻害剤を検証した。特筆すべきは、このモデルが、genOway社がマウスのPD-1遺伝子座にヒトの細胞外ドメインを持つキメラPD-1を挿入して開発したヒト化PD-1マウスであった点である。 これらのマウスには、同じくgenOway社が作成した、ヒトPD-L1を発現する大腸がんMC38細胞が移植された。本研究により、化合物69がPD-1/PD-L1の相互作用を阻害し、T細胞機能の活性化を誘導し、最終的に細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を腫瘍微小環境（TME）に動員することで、腫瘍の増殖を強力に抑制することが示された。

結論として、Rita C. Acurcioらは、低コストでありながらPD-1/PD-L1シグナル伝達経路を調節し、エフェクターCD8 T細胞の腫瘍微小環境への広範な浸潤を促進する、有望な新規低分子候補物質群を同定した。免疫チェックポイント療法の臨床成績を向上させる可能性を秘めた、即用型の製品候補である！

参考文献：

1. Acúrcio RC ほか. J Immunother Cancer 2022;10:e004695. doi:10.1136/jitc-2022-004695.