FLEx技術とオプトジェネティクス：高い空間分解能と時間分解能で遺伝子発現のスイッチを切り替える

数十年前、脳の解明は依然として困難な課題でした。それは科学者たちの知的好奇心が欠けていたからではなく、むしろ利用可能な技術が限られていたためです。しかし、ここ数年、目覚ましい技術の進歩により、研究者たちは現代神経科学の革命の入り口に立っています。FLExや オプトジェネティクスといった技術が融合するこの時代において、科学者たちは脳の機能と機能障害の両方の根本的なメカニズムを解明することが可能になりつつあります。

まずは基本から始めましょう。オプトジェネティクスとは何でしょうか？

光遺伝学：光を用いて神経細胞を制御する

2005年、神経生物学者カール・ダイセロス率いるスタンフォード大学の研究チームは、光学的手法と遺伝学的手法を組み合わせ、哺乳類のニューロンを光刺激してシナプス活動を変化させることに成功した。こうして新たな技術が誕生し、「オプトジェネティクス」という用語が提唱された（Boyden et al., 2005; Deisseroth et al., 2006）。

オプトジェネティクスは比較的最近開発された技術ではあるが、その歴史は、エネルギー変換や細胞内・細胞間のシグナル伝達経路の誘導のために光子を吸収する光感受性タンパク質である微生物ロドプシンの発見にさかのぼり、その発見はほぼ50年前にさかのぼる（Ernst et al., 2014）。 微生物ロドプシンはオプシン遺伝子によってコードされており、バクテリオロドプシン、ハロロドプシン、チャネルロドプシンが含まれる。前者の2つは古細菌に、後者は緑藻に見られる（Oesterhelt and Stoeckenius, 1971; Matsuno-Yagi and Mukohata, 1977; Foster et al., 1984; Harz and Hegemann, 1991）。これらのタンパク質は、可視光に反応して細胞膜を横切る電荷の流れを制御し、膜電位を維持する（Zhang et al., 2011）。

微生物のロドプシンとニューロンにはどのような共通点があるのでしょうか？ニューロンの刺激は、軸索の膜を横切るイオンの移動によって引き起こされます。一定数の正イオンが細胞膜を通過すると閾値に達し、ニューロンが発火して、軸索を伝って電気信号が送られます（Lodish et al., 2000）。 脳内のほとんどのニューロンは本来、光に敏感ではないため、標的細胞においてオプシン遺伝子を選択的に発現させることで、薬理学的または電気生理学的手法を用いて達成できるものよりもはるかに高い特異性をもって、ニューロンの活動を制御することが可能になる（Deisseroth, 2011; Mei and Zhang, 2012; Towne et al., 2016）。

光遺伝学的神経調節は、光によって可能となります。適切な波長の光が当たると、微生物由来のロドプシンが軸索の膜を横切ってイオンが流れるようにし、それによって神経活動を制御します（Bernstein and Boyden, 2011; Mei and Zhang, 2012）。 例えば、青色光はチャネルロドプシンを活性化し、それが神経興奮を引き起こすのに対し、黄色光はハロロドプシンを活性化して神経活動を抑制する（図1）（Wiegert et al., 2017）。

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図1 | 画像出典：https://i1.wp.com/sitn.hms.harvard.edu/wp-content/uploads/2016/04/Lyon_2.png

オプシンを脳内に送り込むにはどうすればよいか？

脳内でオプシンを発現させるため、研究者らは微生物由来のロドプシンをコードする遺伝子組み換えウイルスを、脳の特定の領域に注入する。 こうしてウイルスに感染したニューロンは、その後、注入部位に直接埋め込まれ、レーザーに接続された光ファイバーカニューレを介して光刺激を受ける。レーザーは特定の波長の光を点滅させ、ニューロンの活動を選択的にオンまたはオフにする（Atasoy et al., 2008; Taylor et al., 2016; Hooper and Maguire, 2016）。

組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、比較的安定した染色体外での長期発現と、自然免疫応答を誘導する能力が低いことから、中枢神経系における遺伝子導入手段としてますます普及している（Fenno et al, 2011）。 しかし、rAAVには特定の神経細胞サブポピュレーションを特異的に感染させる能力が欠けており、これが光遺伝学における大きな欠点となっている（Belzung et al, 2014）。これは、オプシン遺伝子を細胞型特異的プロモーターに融合させることで克服できる可能性があるが、それらのプロモーターは通常、下流の遺伝子の発現を弱くしか誘導しない。 一方、強力な細胞特異的プロモーターは、5 kb未満の配列しかパッケージングできないrAAVにとっては長すぎる（Hirsch et al, 2016; Hudry and Vandenberghe, 2019）。では、特定の神経細胞タイプにおいて強力なオプシン発現を実現するにはどうすればよいのか？ ここでFLExが登場する！

FLEx：夜が迫る時、あなたを照らす光！

FLEx（flip-excisionの略）スイッチは、DIO（Double-floxed Inverse Orientation）またはDO（Double-floxed Orientation）とも呼ばれ、生体内において遺伝子発現を時間的・空間的に精密に制御できる非常に強力なツールである in vivo において、遺伝子発現を精密に制御できる非常に強力なツールである（Schnütgen et al., 2003）。 これは、CreやFlpなどの部位特異的組換え酵素が、定義された認識部位（それぞれloxPおよびFRT）でDNA組換えを誘導することによって実現される（Abremski and Hoess, 1984; Van Duyne, 2001; Christenson Wick and Krook-Magnuson, 2018）。

光遺伝学的FLExベクターには、オプシン遺伝子（例：チャネルロドプシン-2、ChR2）の上流に強力なプロモーターが含まれており、このオプシン遺伝子はレポーター遺伝子（例：mCherry）と融合されているため、オプシンを発現する細胞を容易に検出することができます。 その結果生じる融合遺伝子は、その発現を防ぐためにプロモーターに対してアンチセンス方向に挿入され、反対方向を向いた 2 組の非互換性認識部位（例：loxP および lox511）に挟まれています（「floxed」）。 Creは不一致の認識部位間では組換えを引き起こさないため、Creの存在により、まずオプシンの反転が起こり、続いてlox部位の切除が誘導され、その結果、オプシンは転写されるための正しい向きに固定される（図2）（Sharma and Zhu, 2014）。

FLExは、特定の神経細胞においてオプシンの強力な発現をどのように可能にするのでしょうか？ これは、光遺伝学用FLExベクターなどのCre依存性ウイルスを、トランスジェニック動物、あるいは特定の細胞型プロモーターの下でCreを発現するrAAVと組み合わせて使用することで実現できる。脳内に注入されると、ウイルスは不活性なオプシン遺伝子を持つすべての細胞に感染する。しかし、Creを発現する細胞では、Creが二重フロックス化されたオプシン構築体の組換えを誘導し、それによって特定の神経細胞においてのみ、強力なプロモーターの下でその発現が可能となる。 したがって、FLExは空間的な精度と強力なオプシン発現を保証し、これらはどちらも、生理学的および行動学的プロセスを研究する上でオプトジェネティクスにおいて不可欠である（Abdallah et al, 2018; Deubner et al., 2019）。

図2 | FLExスイッチ戦略。ChR2-mCherryの発現はCreを介した現象である。リコンビナーゼが存在しない場合、逆向きに配置されたChR2-mCherryは発現しない。 向きが逆のloxP（紫色の三角形）およびlox511（青色の三角形）部位により、Creを介した組換えと、プロモーターに対するChR2-mCherry配列の反転が可能となり、それによってその発現が許容される。ChR2：チャネルロドプシン-2。図はAtasoy et al., 2008より転載。

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例えば、テイラーらは、rAAV FLExベースのベクターを用いて、睡眠や麻酔のメカニズムの背景にある神経回路を研究した。 Creトランスジェニックマウスにおいて、彼らは、以前から睡眠の調節に重要であることが分かっていた脳の腹側被蓋野（VTA）のドーパミン（DA）ニューロンを標的とした。特に、彼らは、定常状態の全身麻酔下に置かれていたマウスにおいて、DAニューロンへの光遺伝学的刺激が、覚醒を示す行動的および脳波学的証拠をもたらすことを発見した（Taylor et al., 2016）。

興味深いことに、まさにこれらのニューロンは、動機付けられた行動においても中心的な役割を果たしている（Juarez and Han, 2016）。しかし、つい最近まで、ドーパミン（DA）ニューロンのどの亜集団が、嫌悪刺激ではなく快求刺激を活性化できるのかは、まったく不明であった。最近の論文において、de JongらはrAAV FLExベースのベクターを用いてこの疑問に答え、VTAのDAニューロンの活動をマッピングし、その特性を解明した。 in vivo 光遺伝学的刺激を用いることで、この脳領域の個別のサブポピュレーションからの電気的インパルスを同時に記録し、嫌悪行動や報酬関連行動を誘発する神経入力を分離することが可能であることを実証した。 FLExベクターの高い時空間的精度と可逆的な調節機能に加え、異なる脳領域を標的とする複数のCreトランスジェニックマウスを併用することで、動機付け行動に関連する脳領域の神経回路構造について、詳細かつ機能的なトポグラフィーを描き出すことが可能となった（de Jong et al, 2019）。したがって、FLExベクターは、脳の細胞および分子メカニズムを理解するためのオプトジェネティクスにとって理想的なパートナーである in vivo。

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参考文献：

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