FLEx技術とオプトジェネティクス：高い空間分解能と時間分解能で遺伝子発現のスイッチを切り替える

数十年前、脳の解明は依然として困難を極めていました。それは科学者たちの知的好奇心が欠けていたからではなく、むしろ利用可能な技術が限られていたためでした。しかし、ここ数年、目覚ましい技術の進歩により、研究者たちは現代神経科学の革命の入り口に立っています。FLExや オプトジェネティクスといった技術が融合するこの時代において、科学者たちは脳の機能と機能障害の両方の根本的なメカニズムを解明することが可能になりつつあります。

まずは基本から始めましょう。オプトジェネティクスとは何でしょうか？

光遺伝学：光を用いて神経細胞を制御する

2005年、神経生物学者カール・ダイセロス率いるスタンフォード大学の研究チームは、光学的および遺伝学的手法を組み合わせ、哺乳類のニューロンを光刺激してシナプス活動を変化させることに成功した。こうして新たな技術が誕生し、「オプトジェネティクス」という用語が提唱された（Boyden et al., 2005; Deisseroth et al., 2006）。

オプトジェネティクスは比較的最近開発された技術であるにもかかわらず、その歴史は、エネルギー変換や細胞内・細胞間のシグナル伝達経路の誘導のために光子を吸収する光感受性タンパク質である微生物ロドプシンの発見にさかのぼり、その発見はほぼ50年前にさかのぼる（Ernst et al., 2014）。 微生物ロドプシンはオプシン遺伝子によってコードされており、バクテリオロドプシン、ハロロドプシン、チャネルロドプシンが含まれる。前2つは古細菌（アーキア）に、3つ目は緑藻に見られる（Oesterhelt and Stoeckenius, 1971; Matsuno-Yagi and Mukohata, 1977; Foster et al., 1984; Harz and Hegemann, 1991）。これらのタンパク質は、可視光に反応して細胞膜を横切る電荷の流れを制御し、膜電位を維持する（Zhang et al., 2011）。

微生物のロドプシンとニューロンにはどのような共通点があるのでしょうか？ニューロンの興奮は、軸索の膜を横切るイオンの移動によって引き起こされます。一定数の陽イオンが細胞膜を通過すると閾値に達し、ニューロンが発火して、軸索に沿って電気信号が伝達されます（Lodish et al., 2000）。 脳内のほとんどのニューロンは本来、光に敏感ではないため、標的細胞においてオプシン遺伝子を特異的に発現させることで、薬理学的または電気生理学的手法を用いて達成できるものよりもはるかに高い特異性をもって、ニューロンの活動を制御することが可能となる（Deisseroth, 2011; Mei and Zhang, 2012; Towne et al., 2016）。

光遺伝学的神経調節は、光によって可能となる。適切な波長の光を照射すると、微生物由来のロドプシンが軸索の膜を横切ってイオンが流れるようにし、それによって神経活動を制御する（Bernstein and Boyden, 2011; Mei and Zhang, 2012）。 例えば、青色光はチャネルロドプシンを活性化し、それが神経興奮を引き起こすのに対し、黄色光はハロロドプシンを活性化して神経活動を抑制する（図1）（Wiegert et al., 2017）。

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図1 | 画像出典：https://i1.wp.com/sitn.hms.harvard.edu/wp-content/uploads/2016/04/Lyon_2.png

オプシンを脳内に送り込むにはどうすればよいか？

脳内でオプシンを発現させるため、研究者らは微生物由来のロドプシンをコードする遺伝子改変ウイルスを、脳の特定の領域に注入する。 こうしてウイルスに感染したニューロンは、その後、注入部位に直接埋め込まれ、レーザーに接続された光ファイバーカニューレを介して光刺激を受ける。レーザーは特定の波長の光を点滅させ、ニューロンの活動を選択的にオンまたはオフにする（Atasoy et al., 2008; Taylor et al., 2016; Hooper and Maguire, 2016）。

組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、比較的安定した染色体外での長期発現と、自然免疫応答を誘導する能力が低いことから、中枢神経系における遺伝子導入手段としてますます広く用いられるようになってきた（Fenno et al, 2011）。 しかし、rAAVには特定の神経細胞亜集団を特異的に感染させる能力が欠けており、これがオプトジェネティクスにおける大きな欠点となっている（Belzung et al, 2014）。これは、オプシン遺伝子を細胞型特異的プロモーターに融合させることで克服できる可能性があるが、それらのプロモーターは通常、下流遺伝子の発現を弱くしか誘導しない。 一方、強力な細胞特異的プロモーターは、5 kb未満の配列しかパッケージングできないrAAVにとっては長すぎる（Hirsch et al, 2016; Hudry and Vandenberghe, 2019）。では、特定の神経細胞タイプにおいて強力なオプシン発現を実現するにはどうすればよいのか？ ここで登場するのがFLExである！

FLEx：夜が迫る時、あなたを照らす光！

FLEx（flip-excisionの略）スイッチは、DIO（Double-floxed Inverse Orientation）またはDO（Double-floxed Orientation）とも呼ばれ、遺伝子発現を時間的・空間的に精密に制御できる非常に強力なツールである in vivo (Schnütgen et al., 2003)。 これは、CreやFlpといった部位特異的組換え酵素が、定義された認識部位（すなわち、それぞれ loxP および FRT）で DNA 組換えを誘導することによって実現される（Abremski and Hoess, 1984; Van Duyne, 2001; Christenson Wick and Krook-Magnuson, 2018）。

光遺伝学的FLExベクターには、オプシン遺伝子（例：チャネルロドプシン-2、ChR2）の上流に強力なプロモーターが含まれており、このオプシン遺伝子はレポーター遺伝子（例：mCherry）と融合されているため、オプシンを発現する細胞を容易に検出することができます。 その結果生じる融合遺伝子は、その発現を防ぐためにプロモーターに対してアンチセンス方向に挿入され、反対方向の2組の非互換な認識部位（例：loxPおよびlox511）に挟まれています（「floxed」）。 Creは不一致の認識部位間では組換えを引き起こさないため、Creの存在により、まずオプシンの反転が起こり、続いてlox部位の切除が誘導され、その結果、オプシンは転写されるための正しい向きに固定される（図2）（Sharma and Zhu, 2014）。

FLExは、特定の神経細胞においてオプシンの高発現をどのように実現するのでしょうか？ これは、オプトジェネティクス用FLExベクターなどのCre依存性ウイルスと、特定の細胞型プロモーターの下でCreを発現するトランスジェニック動物またはrAAVを組み合わせて使用することで実現できる。脳内に注入されると、ウイルスは不活性なオプシン遺伝子を持つすべての細胞に感染する。しかし、Creを発現する細胞では、Creが二重フロックス化されたオプシン構築体の組換えを誘導し、それによって特定の神経細胞においてのみ、強力なプロモーターの下でその発現が可能となる。 したがって、FLExは空間的な精度と強力なオプシン発現を保証し、これらはどちらも、生理学的および行動学的プロセスを研究する上でオプトジェネティクスにおいて不可欠な要素である（Abdallah et al, 2018; Deubner et al., 2019）。

図2 | FLExスイッチ戦略。ChR2-mCherryの発現はCreを介した現象である。リコンビナーゼが存在しない場合、逆向きに配置されたChR2-mCherryは発現しない。 向きが逆のloxP（紫色の三角形）およびlox511（青色の三角形）部位により、Creを介した組換えと、プロモーターに対するChR2-mCherry配列の反転が可能となり、それによってその発現が許容される。ChR2：チャネルロドプシン-2。図はAtasoy et al., 2008より改変。

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例えば、テイラーらは、rAAV FLExベースのベクターを用いて、睡眠や麻酔のメカニズムの背景にある神経回路を研究した。 Creトランスジェニックマウスにおいて、彼らは、以前より睡眠の調節に重要であることが分かっていた脳の腹側被蓋野（VTA）のドーパミン（DA）ニューロンを標的とした。特に、彼らは、定常状態の全身麻酔下にあったマウスにおいて、DAニューロンへの光遺伝学的刺激が、覚醒を示す行動的および脳波学的証拠をもたらすことを発見した（Taylor et al., 2016）。

興味深いことに、これらまさに同じニューロンは、動機付けされた行動においても中心的な役割を果たしている（Juarez and Han, 2016）。しかし、つい最近まで、ドーパミン（DA）ニューロンのどの亜集団が、嫌悪刺激ではなく快求刺激を活性化させるのかは、まったく不明であった。最近の論文において、de Jongらは、この疑問に答えるためにrAAV FLExベースのベクターを用い、VTAのDAニューロンの活動をマッピングし、その特性を解明した。 in vivo 光遺伝学的刺激を用いることで、この脳領域の個別のサブポピュレーションからの電気的インパルスを同時に記録し、嫌悪行動や報酬関連行動を誘導するための神経入力を分離することが可能であることを実証した。 FLExベクターの高い時空間的精度と可逆的な調節機能に加え、異なる脳領域を標的とする複数のCreトランスジェニックマウスを併用することで、動機付け行動に関連する脳領域の神経回路構造について、詳細かつ機能的なトポグラフィーを描き出すことが可能となった（de Jong et al, 2019）。したがって、FLExベクターは、脳の細胞的・分子的メカニズムを理解するためのオプトジェネティクスにとって理想的なパートナーである in vivo。

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参考文献：

Abdallah, Khaled ほか. 「マウス一次求心性神経におけるアデノ随伴ウイルス2/9を用いたCreリコンビナーゼの送達」. Scientific Reports 8 (2018) 7321. PMID: 29743652. PMCID: PMC5943452.

Abremski, Ken および Ronald Hoess. 「バクテリオファージ P1 の部位特異的組換え。Cre リコンビナーゼタンパク質の精製と特性」『The Journal of Biological Chemistry』259 (1984): 1509-1514. PMID: 6319400.

Atasoy, Deniz ほか「FLEXスイッチは、イメージングおよび長距離回路マッピングのために、チャネルロドプシン-2を複数の細胞タイプに標的化する」『The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience』28 (2008): 7025-7030. PMID: 18614669.

Belzung, Catherine ほか。「恐怖およびうつ様行動の神経回路の研究における光遺伝学：批判的分析」。『Pharmacology Biochemistry and Behavior』122 (2014): 144-157。PMID: 24727401。

Bernstein, Jacob G および Edward S Boyden. 「行動の神経回路を解析するための光遺伝学的ツール」『Trends in cognitive sciences』15 (2011): 592-600. PMID: 22055387. PMCID: PMC3225502.

Boyden, Edward S 他. 「ミリ秒スケールでの、遺伝的に標的を絞った神経活動の光制御」『Nature Neuroscience』8 (2005): 1263–1268. PMID: 16116447.

Christenson Wick、Zoé、およびEsther Krook-Magnuson。「特異性、汎用性、そして継続的な発展：てんかん研究における光遺伝学の力」。『Frontiers in cellular neuroscience』12 (2018)。PMID: 29962936。PMCID: PMC6010559。

de Jong, Johannes W, 他. 「中辺縁系ドーパミン系における嫌悪刺激の符号化に関する神経回路メカニズム」. Neuron (2019) 133-151. PMID: 30503173. PMCID: PMC6317997.

Deisseroth, Karl, et al. 「遺伝子標的化された脳回路を可視化するための次世代光学技術」『Journal of Neuroscience』26 (2006): 10380-10386. PMID: 17035522. PMCID: PMC2820367.

Deisseroth, Karl. 「オプトジェネティクス」. 『Nature Methods』 8 (2011): 26-29. PMID: 21191368.

Deubner, Jan 他。「哺乳類の脳を研究するための光遺伝学的アプローチ」。『Current Opinion in Structural Biology』、57 (2019): 157-163。PMID: 31082625。

Ernst, Oliver P 他. 「微生物および動物のロドプシン：構造、機能、および分子メカニズム」. Chemical Reviews 114 (2014): 126-63. PMID: 24364740. PMCID: PMC3979449.

Fenno, Lief ほか「光遺伝学の発展と応用」。『Annual Review of Neuroscience』34 (2011): 389-412。PMID: 21692661。PMCID: PMC6699620。

Foster, Kenneth W 他. 「単細胞真核生物クラミドモナスにおける光走性に関与する機能的な光受容体はロドプシンである。」『Nature』311 (1984): 756-759. PMID: 6493336.

ハルツ、ハートマン、およびピーター・ヘゲマン。「クラミドモナスにおけるロドプシンによって調節されるカルシウム電流」。『ネイチャー』351号（1991年）：489-491頁。

Hirsch, Matthew L ほか. 「AAVベクターの運搬能力を超えるトランスジェニックDNAの送達」. 『Methods in molecular biology』 1382 (2016): 21-39. PMID: 26611576. PMCID: PMC4971574.

Hooper, Andrew および Jamie Maguire. 「コルチコトロピン放出ホルモンを発現する海馬介在ニューロンの新規サブタイプの特性解析」. 『Hippocampus』 26 (2016): 41-53. PMID: 26135556.

Hudry, Eloise および Luk H. Vandenberghe. 「神経系への治療用AAV遺伝子導入：臨床的現実」『Neuron』101 (2019): 839-862. PMID: 30844402.

Juarez, Barbara, and Ming-Hu Han. 「薬物曝露に対するドーパミン作動性神経回路の多様性」『Neuropsychopharmacology』41 (2016): 2424-2446. PMID: 26934955. PMCID: PMC4987841.

Lodish, Harvey ほか『Molecular Cell Biology』. ニューヨーク：W. H. Freeman、2000年。書架ID：NBK21668。

松野・八木明美、向畑康夫。「バクテリオロドプシンの2つの考えられる役割：色素組成が異なるHalobacterium halobium株の比較研究」。『Biochemical and Biophysical Research Communications』78 (1977): 237-243. PMID: 20882.

Mei, Yuan, Feng Zhang. 「オプトジェネティクスのための分子ツールとアプローチ」『Biological Psychiatry』71 (2012): 1033-1338. PMID: 22480664. ディーター・オースターヘルト、ヴァルター・シュトッケニウス。「Halobacterium halobiumの紫膜由来のロドプシン様タンパク質。」『Nature: New Biology』233 (1971): 149-152. PMID: 4940442.

Schnütgen, Frank 他. 「マウスにおいて細胞レベルでCre媒介再組換えをモニタリングするための方向性のある戦略」. 『Nature Biotechnology』 21 (2003): 562–565. PMID: 12665802.

Sharma, Suveena および Jinfang Zhu. 「マウスにおけるコンディショナル 遺伝子改変技術の免疫学的応用」. 『Current protocols in immunology』 105 (2014): 1-13. PMID: 24700321. PMCID: PMC4100247.

Taylor, Norman E, et al. 「腹側被蓋野のドーパミン神経細胞の光遺伝学的活性化は、全身麻酔からの覚醒を誘導する。」『米国科学アカデミー紀要』113 (2016): 12826-12831. PMID: 27791160. PMCID: PMC5111696.

Towne, Chris および Kimberly R Thompson. 「オプトジェネティクスの研究と臨床応用に関する概説」. 『Current Protocols in Pharmacology』 75 (2016): 1-21. PMID: 27960028.

Van Duyne, Gregory D. 「cre-loxp 部位特異的組換えの構造的考察」『Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure』30 (2001): 87-104. PMID: 11340053.

Wiegert, J Simon ほか. 「ニューロンのサイレンシング：ツール、応用、および実験上の制約」. 『Neuron』 95 (2017): 504-529. PMID: 28772120. PMCID: PMC5830081.

Zhang, Feng ほか「光遺伝学ツールとしての微生物オプシンファミリー」。『Cell』147 (2011): 1446-1457. PMID: 22196724. PMCID: PMC4166436.