プライム・エディティング：まだ発展途上ではあるが、すでに非常に注目を集めている新しい遺伝子編集ツール

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Anzalone AV、Randolph PB、Davis JR、Sousa AA、Koblan LW、Levy JM、Chen PJ、Wilson C、Newby GA、Raguram A、LiuDR
。二本鎖切断やドナーDNAを必要としない検索・置換型ゲノム編集。
『Nature』2019年10月。

CRISPR/Cas9システムの発見以来、遺伝子編集の研究コミュニティは、二本鎖切断（DSB）の修復効率と予測可能性の向上に多大な努力を注いできた。 実際、Cas9はDSBを媒介し、そのDSBはその後、以下の2つの細胞内DNA修復メカニズムのいずれかによって修復される。すなわち、小さな挿入や欠失（インデル）を引き起こす非相同末端結合（NHEJ）か、切断部位に外因性のドナーDNAを組み込むことができる相同性依存修復（HDR）である。⁽¹⁾NHEJはDSB発生後に生じる主要な経路であるため、インデルは精密な遺伝子編集にとって大きな問題となっている。2016年、David Liu博士らは、精密な点変異を導入するための代替技術として、DSBを形成することなく単一ヌクレオチドを置換する「塩基編集（BE）」を提案した。⁽²⁾その後の研究により、この手法は一部の変異に対しては極めて効率的であるものの、限界があることが示された。^{(3, 4, 5)}先週、リウ博士の研究グループによる新たな研究が『Nature』誌で早期プレビュー公開され、DSBを介した改変に代わるさらなる選択肢が提示された^。(6)

^{図：DSBを介したHDR、ベースエディティング、プライムエディティングの主な特徴}

本研究において、アンザローネ博士らは、Cas9を基盤とする全く新しい遺伝子編集ツール「プライムエディティング（prime editing）」を開発した経緯について述べている。このツールにより、転移、転位、挿入、欠失、およびこれらの変化の組み合わせといった、効率的かつ精密な改変が可能となる。このシステムには、最適化された逆転写酵素（RT）と融合したCas9ニッカースからなる「プライムエディター（PE）」と、2つのRNA分子が必要となる。 1つ目のRNA分子は「プライムエディティングガイドRNA（pegRNA）」と呼ばれ、Cas9ニッカースの構造的足場として機能し、他のシングルガイドRNA（sgRNA）と同様に、酵素を特定のDNA位置へと誘導する。しかし、sgRNAとは異なり、pegRNAはRTのドナーおよびテンプレートとしても作用する。 2つ目のRNA分子はsgRNAであり、プライム編集の効率を高めるために、対向するDNA鎖上に2つ目のニックを形成するために使用される。以下に、プライム編集による改変に至る一連の過程を要約する：

1. PE:pegRNA複合体は、DNA上の特定の位置に一本鎖のニックを形成する
2. RTは、pegRNAを鋳型として、編集された新しいDNAを重合させる
3. その後、sgRNAを用いて編集対象外のDNA鎖にニックを形成することで、その修復を促進し、両方のDNA鎖に所望の編集を挿入するようにする

  By getting rid of DSBs and donor DNA entirely, the authors appear to bypass, or at least strongly limit, the very unfortunate problem of indel-creation predominance (caused by NHEJ) over precise mutation insertion (typical of HDR). Prime editing, however, can only be used for rather small modifications (< 100 base pairs), and does not represent, therefore, an alternative tool for larger insertions or deletions.

  このまったく新しいシステムは、Cas9に由来するツールボックスへの最後にして非常に有望な追加要素です。実際、BEやDSBを介したHDRを用いた精密な遺伝子編集における大きな制約は、変異の挿入を意図する部位のすぐ近くにプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）が存在する必要があるという点です。 プライムエディティングでは、PAM配列から最大30ヌクレオチド離れた位置に目的の改変を挿入することが可能であり、これは既存の技術に比べて飛躍的な進歩である。 さらに、RT（逆転写酵素）はエラーが発生しやすいことが知られている（ウイルス学者なら誰でもそう言うだろう）が、プライムエディティングは、精密な遺伝子編集において他の技術よりも効率的である。しかし、プライムエディティングがホモ接合体変異（すなわち、すべての対立遺伝子を一度に標的とする）に対して効率的かつ信頼性が高いかどうかは、依然として不明である。これが実現すれば、DSBを介したHDRに対するもう一つの大きな利点となるだろう。

  著者らが指摘しているように、プライムエディティングによって引き起こされるゲノム全体のオフターゲットや生理学的異常を完全に解明するには、さらなる研究が必要である。とはいえ、このシステムは病原性変異を修正するための主力技術となる可能性がある。まだ完全な成熟段階には至っていないものの、このシステムは精密な遺伝子編集を行うための有望な新たなツールである。

参考文献：

1. Mali, Prashant 他「Cas9を用いたRNA誘導型ヒトゲノム改変」『 Science』2013年2月15日
2. Komor, Alexis C 他「二本鎖DNAの切断を伴わないゲノムDNA中の標的塩基のプログラム可能な編集」『 Nature』2016年5月19日
3. Kim, Y Bill 他、「改変されたCas9-シチジンデアミナーゼ融合タンパク質を用いた塩基編集のゲノム標的範囲と精度の向上」 。 『 Nat Biotechnol』2017年4月
4. Zuo, Erwei 他「シトシン塩基エディターはマウス胚において相当量のオフターゲット単一ヌクレオチド変異を生成する」 。 『 Science』。2019年4月19日
5. Grünewald, Julian 他「CRISPR誘導型DNA塩基エディターによって誘発されるトランスクリプトーム全域にわたるオフターゲットRNA編集」『 Nature 』 2019年5月
6. Anzalone, Andrew V 他「二本鎖切断やドナーDNAを必要としない検索・置換型ゲノム編集」 『Nature』2019年10月21日
7. Kosicki, Michael 他「CRISPR-Cas9によって誘発された二本鎖切断の修復は、大規模な欠失および複雑な再構成をもたらす」『 Nat Biotechnol』2018年9月
8. Rezza, Amélie 他「CRISPR/Cas9によるノックインに関連する標的遺伝子座における予期せぬゲノム再編成」『 Sci Rep』2019年3月5日