CRISPR：豊富なツールボックスだが、万能ではない

この2年間、新聞の科学欄をちらっとでも目にしたことがあるなら、ゲノム工学における最新の有望な発見である「CRISPR」という言葉を耳にしたことがあるでしょう。 「クラスター化された規則的に間隔を置いた短い回文反復配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）」と呼ばれるこのシステムは、私たちの小さな友である細菌のおかげで、実に強力なツールとなっています。これは、細菌が侵入してきた病原体を記憶できるようにする適応免疫システムであり、現時点で原核生物において唯一知られているものです(1)。細菌は、侵入してきたDNAの短い配列を自身のゲノムに組み込むことで、その侵入者が再び現れた際にそれを認識し、排除することができるのです。

CRISPR/Casシステムは、その発見以来、DNAを切断できるCRISPR酵素という1つのタンパク質と、特定の配列を標的とする1つのRNA分子のみを用いて、数多くの真核細胞での利用に適応・改良されてきました。この驚くほどシンプルなシステムは、DNA上の任意の場所に、1塩基単位の精度で二本鎖切断（DSB）を導入することができます。 プログラム可能なシステムとして初めて利用されてから約5年が経ち、今やすべての科学者がこのシステムを知っており、その大半が、自身の研究をどのように前進させられるかを検討してきた。

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CRISPRは、洗練された標的特異的な二重鎖切断（DSB）誘導ツールから、まさに溢れんばかりのツールボックスへと変貌を遂げました。効率的な遺伝子編集ツールであることに加え、現在では作物の改良、転写の制御、エピジェネティックな修飾の誘導(2)、そして高感度かつ低コストでのウイルス（現時点ではジカウイルスやデング熱ウイルス）の検出(3)などに利用されており、これらはほんの一例に過ぎません。このシステムの最も興味深い特徴の一つは、スクリーニングへの応用です。 この技術では、多数の標的（場合によっては15万以上）に結合するように設計された単一のRNA分子からなるライブラリが用いられる(4)。これまでに、1万8,000以上の個々の遺伝子を系統的にノックアウトすること(5,6)、新たな適応度遺伝子（細胞の成長や増殖に関与する遺伝子）の同定(4)、そして新たながん免疫療法の標的の特定(7)などに応用されてきた。

がんといえば、CRISPRの発見は、治療法として即座に大きな期待を呼び起こしました。現時点で開始された臨床試験はごくわずかですが（確かに、開発から5年しか経っていない技術としてはごく自然なタイミングです）、全体的な熱狂にもかかわらず、このシステムの特異性や、やや予測不可能なオフターゲットに関する初期の懸念は、依然として完全には払拭されていません。 オフターゲットの特定に焦点を当てた様々な研究が行われており、その中には最近発表された、非常に物議を醸し、かなり警戒感を煽るような報告(8)も含まれている。また、こうした望ましくない副作用を低減するためのシステムの改良について記述した研究も数多く存在する(9–11)。こうした取り組みにより、オフターゲットに関する懸念はまもなく完全に解消されるかもしれないが、まだその段階には至っていない。

たとえシステムの特異性が完璧であったとしても、CRISPRが特定の遺伝子編集用途において理想的なシステムとなるには、CRISPR自体が引き起こす修復メカニズムそのもののために、依然として障壁が存在する。 実際、CRISPR酵素がDNAを切断すると、2つの異なる修復メカニズムが誘導される可能性がある。非相同末端結合（NHEJ）は二本鎖切断（DSB）部位に小さな挿入や欠失（インデル）をもたらす一方、相同性依存修復（HDR）は切断部位に外因性のドナーDNAを組み込むことができる。 遺伝子編集の専門家にとって非常に厄介なことに、CRISPRによる切断後はNHEJが圧倒的に優勢であり、ドナーDNAを組み込む場合でも、かなり予測不可能なインデルが生じることになる。これらのインデルは、フレームシフトを誘発してノックアウトにつながるため有用な場合もあるが、特に点変異や大規模なノックインにおいては、精密な遺伝子編集にとって大きな問題となる。 その結果、CRISPRを用いて得られた細胞、クローン、あるいは動物のゲノムについては、導入された正確な変異を特定するために、入念なシーケンシングを行う必要がある。

予測不可能なオフターゲットやインデルは、細胞を扱う際にはそれほど厄介なことではないかもしれませんし、一部の種のゲノムを編集するには最良かつ最も効率的な方法でもあります（遺伝子組み換えラットが再び注目を集めています）。しかし、信頼性が高く、堅牢で、かつ精密なトランスジェニックマウスの作製法を求めるならば、特に大規模なノックインにおいては、依然として従来の相同組換え（HR）が最も安全な方法であると言えるでしょう。 今日、CRISPRが遺伝子編集をより容易に、迅速に、そして安価にした、素晴らしく有用なシステムであることは否定できません。しかし、これは万能のツールではなく、完璧で信頼性が高く、精密な遺伝子編集ツールとして認められるためには、依然として改善が必要です。

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参考文献：

1. Barrangou, R.ほか.CRISPRは原核生物においてウイルスに対する獲得耐性を提供する。Science 315 , 1709–1712 (2007).
2. Komor, A.C.ほか.真核生物ゲノム操作のためのCRISPRベースの技術.Cell168, 20–36 (2017).
3. Gootenberg, J.S.ほか.CRISPR-Cas13a/C2c2を用いた核酸検出.Science 356 , 438–442 (2017).
4. Hart, T.ほか.高解像度CRISPRスクリーニングにより、適応度関連遺伝子および遺伝子型特異的ながん発症リスクが明らかになった。Cell163, 1515–1526 (2015).
5. Wang, T.et al. CRISPR-Cas9システムを用いたヒト細胞における遺伝子スクリーニング。『Science』 343, 80–84 (2014).
6. Shalem, O.ほか.ヒト細胞におけるゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニング.Science343, 84–7 (2014).
7. Manguso, R.T.ほか. In vivo スクリーニングIn vivo 、Ptpn2ががん免疫療法の標的であることが判明した。Nature(2017). doi:10.1038/nature23270
8. Schaefer, K.A.et al. in vivoCRISPRin vivo予期せぬ変異。Nat. Methods14, 547–548 (2017).
9. Ran, F.A.ほか.ゲノム編集の特異性を高めるための、RNA誘導型CRISPR-Cas9による二重ニッキング.Cell154, 1380–1389 (2013).
10. Mali, P.ほか.標的特異性スクリーニングのためのCAS9転写活性化因子および協調的ゲノム工学のためのペアニックカーゼ.Nat. Biotechnol.31, 833–8 (2013).
11. Fu, Y.ほか. 切断型ガイドRNAを用いたCRISPR-Casヌクレアーゼの特異性の向上.Nat. Biotechnol.32, 279–84 (2014).