CRISPR/Cas9を介したノックインに関連する標的遺伝子座における予期せぬゲノム再編成

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Rezza A、Jacquet C、Le Pillouer A、Lafarguette F、Ruptier C、Billandon M、Isnard Petit P、Trouttet S、Thiam K、Fraichard A、Chérifi Y.「
CRISPR/Cas9を介したノックインに関連する標的遺伝子座における予期せぬゲノム再編成」。
Sci Rep. 2019年3月5日。

細菌の適応免疫システムが、極めて洗練された遺伝子編集ツール「CRISPR」へと変貌を遂げ、遺伝子編集研究界に衝撃が走ってから、すでに6年近くが経過した。単一の酵素と1つのRNA分子を用いて、特定のDNA配列を標的としてDSB（二本鎖切断）を引き起こすこのシステムは、専門外の人々にもその名が知れ渡っている。

この有望なツールはその後、広く利用されるようになり、当研究室を含む多くの研究グループがその改良と最適化に貢献してきました。切断効率やオフターゲット現象の抑制には大きな関心が寄せられており、その結果、改良されたCRISPR酵素や、ガイドRNA設計のための最適化されたアルゴリズムが開発されるに至りました。

興味深いことに、この手法の効率性については、相同組換え（HR）が可能な細胞、すなわち胚性幹細胞（ES細胞）を用いた比較が徹底的に行われていない。ごく最近、いくつかの研究により、CRISPRを使用すると、標的遺伝子座において複雑で予測不可能な改変が生じる可能性があることが示唆されている。

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『Scientific Reports』誌に新たに掲載された我々の論文では、マウスES細胞において、128の遺伝子座を対象に、大きなDNA断片（1.5kb以上）の標的挿入について、CRISPR/Cas9（ペアのニカゼを使用）と従来型のホモログ再組み換え（HR）の効率を系統的に比較した。

この大規模な研究により、CRISPR/Cas9を用いることでより多くのクローンを検出できたものの、検証済みの組換えクローンの作製という点では、最終的には従来のHRの方が効率的であることが示された。

興味深いことに、我々は、CRISPR/Cas9による遺伝子編集が、予測外のオンターゲットゲノム再編成を繰り返し引き起こすことも明らかにした。我々の知る限り、CRISPRで編集された試料のオンターゲット特性に関する詳細な解析を含んだ大規模な研究は、これが初めてである。

本研究は、我々の先行研究（1）と併せて、CRISPR/Cas9が編集クローンの生成において極めて高い効率を示すことを裏付けている。また、この技術を用いて得られたすべての試料について、潜在的なオフターゲットだけでなく、標的遺伝子座においても徹底的な特性評価を行うことが極めて重要であることを強調している。

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(1) これまでのCRISPRに関する論文：

Dehairs J、Talebi A、Cherifi Y、Swinnen JV.
CRISP-ID：サンガーシーケンシングによるCRISPR媒介インデルの解読。
Sci Rep. 2016年7月1日。

Renaud JB、Boix C、Charpentier M、De Cian A、Cochennec J、Duvernois-Berthet E、Perrouault L、Tesson L、Edouard J、Thinard R、Cherifi Y、Menoret S、Fontanière S、de Crozé N、 Fraichard A、Sohm F、Anegon I、Concordet JP、Giovannangeli C.
TALENおよびCRISPR-Cas9ヌクレアーゼを用いた改変オリゴヌクレオチドによるゲノム編集効率と柔軟性の向上。
Cell Rep. 2016年2月24日。

Ménoret S、De Cian A、Tesson L、Remy S、Usal C、Boulé JB、Boix C、Fontanière S、Crénéguy A、Nguyen TH、Brusselle L、 ティナール R、ゴーギエ D、コンコルデ JP、シェリフィ Y、フレイシャール A、ジョヴァンナンジェリ C、アネゴン I.
Cas9およびTALEN改変タンパク質を用いた齧歯類受精卵における相同性依存修復。
Sci Rep. 2015年10月7日。