タンパク質機能ノックアウトマウス

事例研究

事例 1）プロテアーゼ活性の喪失：適切なプロテアーゼ阻害剤の不足を克服するためのモデル

‍YuJW ほか.MALT1のプロテアーゼ活性は、自然免疫および獲得免疫反応に不可欠である。PLoS One. 2015.

MALT1は、抗原受容体シグナル伝達において重要な役割を果たすシグナルソームを構成するタンパク質の一つである。MALT1は、スキャフォールドタンパク質として機能するほか、プロテアーゼとして、下流の抑制性シグナル伝達タンパク質を切断・不活性化させる働きも持つ。
これら2つの異なるMALT1の活性を研究する上で、適切な薬理学的特性を備えた選択的なMALT1プロテアーゼ阻害剤が存在しないことが障壁となっている。

モデル：プロテアーゼの活性部位に挿入された、触媒活性を失わせる^{変異であるMalt1C472Aの}ホモ接合体マウス。これにより、プロテアーゼ活性を完全に失ったノックアウト個体が得られる。

目的：免疫細胞におけるMALT1プロテアーゼ活性の役割を明らかにすること。

結果：MALT1のプロテアーゼ活性は、自然免疫様B細胞集団の分化に不可欠であることが明らかになった。さらに、T依存性およびT非依存性の抗原による免疫化に対するIg応答は、いずれもMALT1のプロテアーゼ活性に依存していた。

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図1. MALT1遺伝子のC472A変異は、タンパク質の発現量に変化をもたらすことなく、プロテアーゼ活性を不活性化させる。

A)C57BL/6由来の胚性幹細胞において、野生型Malt1遺伝子座（I）の相同組換えを利用し、Malt1遺伝子のエクソン12に触媒活性を持たないC472A変異を導入した。

こうして得られたNeoカセットを導入したマウス（II）を、FLPリコンビナーゼを発現するデリターマウス系統と交配させ、本研究で使用したプロテアーゼ不活性型対立遺伝子（III）を持つ個体を作出した。次に、これらのマウスをCreリコンビナーゼを発現するデリター系統と交配させ、エクソン12を切除してヌル対立遺伝子（IV）を作出した。

閉じた三角形はFRTサイト、開いた三角形はloxPサイトです。

B) 野生型（wt）、^Malt1-/-,^{およびMalt1C472Aマウスの}脾臓から精製した全B細胞を、PMAおよびイオノマイシンの存在下（+）または存在しない状態（-）で1時間処理し、ウェスタンブロッティングにより、MALT1、CYLD、Bcl10、およびプロテアーゼによって切断されたCYLDおよびBcl10の発現を評価した。

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図2.^Malt1PD/PD プロテアーゼ不活性マウスでは、辺縁帯（MZ）およびB1 B細胞集団の分化が著しく阻害されている。

MALT1wt、^Malt1-/-, および^Malt1PD/PDマウスにおけるリンパ球集団の代表的なフローサイトメトリー解析。

A、C)脾臓内のMZ B細胞（CD21-CD23+）集団

B、D）腹水中のB1 B細胞（IgMhiCD5lo）集団

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図3. T細胞依存性および非依存性抗原による免疫接種に対する、野生型（wt）、^Malt1-/-, および^Malt1PD/PDマウスの生体内抗体応答。

生体内において、T細胞依存性およびT細胞非依存性の抗体応答を最大限に引き出すには、MALT1プロテアーゼ活性が必要である。

A)wt、Malt1-/-, および^{Malt1PD/PD を}T 細胞依存性抗原である KLH で免疫したところ、wt マウスでは 7 日目から 28 日目にかけて高力価の抗 KLH IgM が産生され、14 日目までに予想通りの Ig クラスの切り替えが起こり、抗 KLH IgG 濃度は 28 日目まで増加し続けた。^Malt1PD/PDマウスも、KLH 免疫に対する IgM および IgG 応答が乏しかった。

B) 野生型（wt）、^Malt1-/-,^{およびMalt1PD/PDマウス}に対し 、T非依存性II型抗原であるTNP-Ficollを用いて免疫を行ったところ、T依存性免疫で観察されたものと同様のIgMプロファイルが得られたが、^{Malt1PD/PDマウスのIg}G応答には有意な影響は見られなかった。これらの結果は、MALT1のプロテアーゼ活性が、生体内におけるT依存性およびT非依存性の抗体応答に寄与していることを示している。

症例 2）結合能の喪失（SH2を介した）：SHORT症候群のヒト疾患モデル

Winnay JN ほか. 生体内におけるインスリンおよび成長因子抵抗性と関連するPI3キナーゼの変異.J Clin Invest. 2016.

SHORT症候群は、低身長、部分的な脂肪異栄養症、およびインスリン抵抗性を特徴とする疾患である。

PI3Kのp85α調節サブユニットをコードする遺伝子におけるヘテロ接合型変異^{（PI3KR1Arg649Tr）が}、患者において同定されている。この変異は、PI3Kがチロシンリン酸化タンパク質に結合するために不可欠な、p85αのC末端SH2ドメインをコードする領域に生じ、インスリン依存性のPI3K経路の活性化を著しく弱める。

モデル：SHORT症候群に罹患したヒトの大部分に見られる変異と相同性を持つ^p85R649W変異のヘテロ接合体マウス。

目的：SHORT症候群に関連するPI3KR1変異が、SHORT症候群患者に見られる異常の根底にある病態生理を説明しているかどうかを評価すること。

結果：患者と同様に、変異マウスにおいても体重および体長の減少、部分的な脂肪異栄養症、および全身性のインスリン抵抗性が認められた。

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図1.^{p85WT/R649Wマウス}における体重および体長の減少。

A)生後24週齢の雌^{のp85αWT/WTマウス}（左）および^{p85αWT/R649Wマウス}（右）の代表的な画像。

B)指定された期間にわたって測定された、^p85αWT/WT（白）^{およびp85αWT/R649W}（赤）マウスの体重。雌マウスは三角形の記号で、雄マウスは丸い記号で示されている。

C-E)生後24週時の体重、および生後12週の雄動物の体長と脛骨長。

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図2. ヘテロ接合体の変異マウスはインスリン抵抗性を示す。

A)Fed^{p85αWT/R649Wマウスは}、野生型マウスと比較して著しい高血糖を示した。

B) ^{p85αWT/R649W}マウスでは、絶食後の血清インスリン濃度が著しく上昇していた。

C)インスリン抵抗性の増加。これは、インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（HOMA-IR）によって測定されたものであり、変異マウスでは有意に上昇していた。