レポーターノッキンマウスの定義とは、ゲノムに蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、または生化学的タグが挿入された動物モデルを指す。このレポーターは、遺伝子の代わりに挿入されたり、タンパク質と融合されたり、あるいは3' UTRに挿入されたりすることがある。

このモデルは、標的タンパク質に対する利用可能な抗体がない場合に特に有用です。

用途

学術研究については：

遺伝子発現のモニタリング
細胞応答のモニタリング
ノックアウトの確認結果の読み取り
タンパク質、細胞および細胞系統の移動
細胞選別
生化学的解析（例：タンパク質間相互作用）

バイオ医薬品の研究開発において：

特定の刺激に対する反応の読み取り
薬物検査‍
生体内センシング
バイオマーカー

レポーター型Knockinマウスモデルの強み

抗体を使用せずに、目的の事象を生体内においてモニタリングすること
あらゆる種類のモデル（ノックアウト、ノックイン、ヒューマナイズ）で使用可能です
レポーターは、標的タンパク質の機能を阻害しないように、プロモーターや転写産物に融合させたり、リンカーを介して結合させたりすることができる

レポーターノックインマウスモデルの限界

レポーターをタンパク質に融合させると、タンパク質の立体構造、局在、および機能が変化する可能性がある
→ この制限は、以下の技術を適用することで回避できる IRES共発現技術を活用することで、この制限を回避できる

1. 3' UTR を用いたアプローチは定量的ではない
2. 発現レベルと発現パターンを維持するには、すべての調節要素を保存することが不可欠である
3. 複数のアイソフォームが報告されている場合、対応が困難となる
→ モデル開発に先立ち、綿密な科学的リスク評価においてこれを予測・考慮しなければならない

事例紹介

このレポーターにより、研究者は遺伝子発現レベルを定量化し、対象となる遺伝子を発現する細胞を追跡し、その遺伝子の制御状況をモニタリングすることが可能となる。これまで、こうしたモデルは、例えば、制御性T細胞のエフェクター機能を定量化するため（事例2）、サイトカイン産生量を定量化するため、サイトカイン産生細胞の経時的な変化を追跡するため、あるいは急速に分裂する赤血球前駆細胞をモニタリングするためなどに構築されてきた（事例1）。

どちらのモデルケースも、IRESを用いて、対象遺伝子の3’UTRにレポーター遺伝子を挿入している。活性化されると、IRES-レポーター-対象遺伝子からなる構築体で構成されるmRNAは、2つの独立したタンパク質として翻訳される。

**事例 1 | 造血幹細胞および急速に分裂する赤血球前駆細胞の生体内モニタリングのための IRES-ルシフェラーゼモデル（genOway 制作）**

Alvarez S、Díaz M、Flach J、Rodríguez-Acebes S、López-Contreras AJ、Martínez D、Cañamero M、Fernández-Capetillo O、Isern J、Passegué E、Méndez J.「
」MCMの発現低下によって引き起こされる複製ストレスは、胎児の赤血球生成および造血幹細胞の機能を制限する。
Nat Commun. 2015.

Mcm3遺伝子の低発現型対立遺伝子を持つマウス系統。

A)マウスMcm3遺伝子の改変対立遺伝子を設計した。この対立遺伝子では、エクソン14～17の両側にloxPサイトが配置され、IRES要素の制御下にある3'UTRにルシフェラーゼレポーターが挿入されている。得られた対立遺伝子（Mcm3-lox）は、Creリコンビナーゼを用いてMcm3の発現を阻害できることから、コンディショナルとして設計された。

B)Mcm3-loxの発現は、ルシフェラーゼの発現に伴う生物発光活性によってモニタリングすることができた。

事例 2 | 制御性T細胞の活性をモニタリングするためのFoxp3-IRES-mRFP（FIR）レポーターマウスモデル

Dioszeghy V、Mondoulet L、Dhelft V、Ligouis M、Puteaux E、Dupont C、Benhamou PH.
経皮免疫療法による制御性T細胞の誘導は持続的であり、ピーナッツ感作マウスにおける好酸球性疾患からの長期的な防御をもたらす。
Clin Exp Allergy. 2014.

Wan YY、Flavell RA.
バイシストロン型レポーターを用いたFoxp3発現抑制性T細胞の同定。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2005.

図1. マウスFoxp3遺伝子座へのIRES-mRFPレポーターの導入。

A)マウスFoxp3遺伝子座、標的DNA構築体、および標的化されたFoxp3遺伝子座の地図。Foxp3遺伝子のエクソン13を含む11 kbのマウスゲノムDNAを、BstZ17I (B) およびHpaI (H) を用いて切断し（上図）、pEasy-Floxベクターのチミジンキナーゼ（TK）選択マーカーの隣接領域にクローニングした。IRES-mRFPおよびloxPで挟まれたネオマイシン（Neo）選択マーカーを含むカセットを、Foxp3遺伝子の翻訳停止コドン（UGA）とポリアデニル化シグナル（_A2UA3）の間のSspI（S）サイトに挿入した（中央）。正しく標的化されたES細胞を用いて、キメラおよび生殖系列伝達マウスを作出しました。Creリコンビナーゼをトランスジェニックに発現するデレーターマウスを使用し、生体内においてNeo遺伝子を除去することで、Foxp3遺伝子座が標的化されたマウスを作出しました（下）。

B)FIRマウスのPCRによる遺伝子型判定。FIRマウスの遺伝子型判定を行うため、3種類のプライマー（P1～P3）を設計した。PCRの結果、野生型（wt）Foxp3対立遺伝子では517 bpの産物が、標的化Foxp3対立遺伝子では470 bpの産物が得られた。

図2. mRFPの発現は、Foxp3を発現するCD4 T細胞を、その制御活性を損なうことなく正確に標識しており、さまざまなリンパ球コンパートメントにおいてFoxp3の発現が検出された。

FIRマウスから末梢リンパ球を採取し、蛍光色素標識された抗CD4抗体および抗CD25抗体で染色した。CD4 T細胞におけるmRFPの発現をフローサイトメトリーにより測定した（左図）。FACSを用いてFIRマウスから精製した末梢CD4 T細胞の各集団（図示の通り）からRNAを抽出した。 Foxp3の相対mRNAレベルはTaqManリアルタイム定量PCRにより測定し、2回の実験結果を統合してプロットした。