時間依存性のコンディショナル ノックアウトマウスは、対象となる遺伝子が「フロックス化」されており、胚期、出生後、あるいは成体動物の特定の時点において時間的に制御可能な誘導型動物モデルを確立するものである。

Cre-ERt2デレーターマウス系統を用いた追加の交配工程を経て、コンディショナル ノックアウトは、外部の誘導剤(多くはタモキシフェンやテトラサイクリンなどの低分子化合物)によって時間的に誘導される。

用途

学術研究の場合:

  • 遺伝子機能の比較研究(オン型とオフセット型)
  • 発症が遅い病態を模倣する
  • 胚致死性状態の研究

バイオ医薬品の研究開発において:

  • ターゲット検証試験
  • オフターゲット効果に関する研究
  • 100%の拮抗関係を模倣する
  • 代償性表現型の回復(化合物の試験)

時間依存性ノックアウトマウスモデルの利点

  • 非常に柔軟性が高く、さまざまな組織における時間依存性のKOの解析に簡単に切り替えることができます
  • deleterマウス(CreまたはFLP)の豊富なリソースにより、さまざまな組織において、時間依存的な遺伝子ノックアウト(KO)のほぼ無限の組み合わせが可能となる
  • このモデルから得られた科学的データの生理学的関連性が高い
  • ほぼ無限の特異性を実現する、数多くの欠失誘導系系統(数千ものCre-FLPマウス系統……)

時間依存性ノックアウトマウスモデルの限界

  • 投与された薬剤の用量に依存する発現レベル
  • 組織へのトリガー化合物の浸透度の違い
  • Cre誘導株の入手可能性と背景
  • loxPサイトを追加すると、スプライシング制御(ESS・ESE)が改変されたり阻害されたりするリスクがあり、重複する遺伝子や隣接する遺伝子に影響が及ぶ可能性がある
    loxPサイトの配置について慎重な分析が必要である
  • テトラサイクリン誘導性システムにはリークが生じることがある
    → Creと、タモキシフェンのみに結合するエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインの変異体(ERtおよびERt2)との融合タンパク質を用いることで、時間的制御が可能となる。この不活性なCre-ERt2融合タンパク質は、タモキシフェン(または4-ヒドロキシタモキシフェン)の投与によって活性化される。

事例研究

胚致死性を回避し、雄の生殖細胞を研究するためのモデル

‍NilsenA 他.マウスにおけるALKBH4の欠損は精子形成障害を引き起こす。PLoS One. 2014.

ALKBH4は、非筋型ミオシンIIがアクチンフィラメントに結合する能力に間接的に影響を及ぼす。このタンパク質は、細胞分裂や細胞運動といった基本的なプロセスを調節しており、着床前の胚の初期段階において、その欠損は致死的な結果をもたらす。

モデル: コンディショナル Alkbh4L/LloxPに挟まれた)マウスをCreEsrトランスジェニックマウス と交配させ、胚致死性を克服した誘導型ノックアウト遺伝子型Alkbh4L/LCreEsrを作成した。

目的:誘導型 Alkbh4ノックアウトマウスを用いて、生理学的状況下におけるALKBH4欠損の影響を調査すること。

結果:ALKBH4は、減数分裂前期における精母細胞の発生に不可欠である。

図1. タモキシフェン(TAM)による治療とAlkbh4の抑制。

図1a - Alkbh4L/Lマウス

A) Alkbh4L/LCreEsrマウスおよび対照マウスにおけるTAM治療の概略図(0日目から14日目まで)。サンプリングの時点が示されている。

B)タモキシフェン投与2週間後のAlkbh4マウスの特定臓器において、loxP配列で挟まれたDNA配列のCre媒介による組換えをPCRにより検出した。

図1b - Alkbh4L/Lマウス

C) タモキシフェン投与2週間後のAlkbh4Δ/Δマウスの精巣全抽出液におけるALKBH4の減少を 、ウエスタンブロット法により検出した。

図1c - Alkbh4L/Lマウス

図2.Alkbh4の欠損により精巣のサイズが縮小する

図2 - Alkbh4L/Lマウス

(左図)タモキシフェン投与1週間後、あるいは未投与(0~1週目)の対照群およびAlkbh4欠損マウス、ならびにAlkbh4欠損後2週間の投与を経たマウスの代表的な精巣。

(右図)タモキシフェンによる1週間の治療前後(0~1週目)の4~5週齢マウス、およびタモキシフェンを2週間投与された6週齢マウスの平均精巣/体重比。

図3.Alkbh4Δ/Δマウスにおける発生段階特異的な精子形成の停止。

A)抗γH2A.X抗体(赤)による組織切片の免疫蛍光染色と、DAPI(青)による対比染色。この画像では、セルトリ細胞(Se)、レプトテン期(L)およびパキテン期(P)の精母細胞、ならびに伸長期精子細胞(S9)を区別することができる。

図3a - Alkbh4L/Lマウス

B)対照群(Alkbh4L/L)およびAlkbh4Δ/Δマウスにおける第IX期の断面あたりの平均細胞密度(組織切片あたり10本以上の細管、計6切片)を比較すると、Alkbh4Δ/Δマウスではタモキシフェン投与2週間後に、パキテン期精母細胞およびS9期の伸長期精子細胞が著しく減少していることが示された。

図3b - Alkbh4L/Lマウス

C) Alkbh4Δ/Δマウスにおける精子形成の特定段階(I、VIII、IX)での平均 細胞密度は、パキネマ期およびそれ以降のすべての段階において細胞数の減少を示している。

図3c - Alkbh4L/Lマウス
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