Souris KO pour l'étude de la fonction d'une protéine

Études de cas

Cas n° 1) Perte d'activité protéasique : modèle permettant de pallier l'absence d'inhibiteurs de protéases adaptés

‍YuJW, et al. L'activité protéasique de MALT1 est nécessaire aux réponses immunitaires innées et adaptatives. PLoS One. 2015.

La protéine MALT1 fait partie des signalosomes qui jouent un rôle important dans la signalisation des récepteurs antigéniques. Elle agit à la fois comme protéine d'échafaudage et comme protéase, permettant de cliver et d'inactiver les protéines de signalisation inhibitrices en aval.
L'étude de ces deux activités distinctes de la MALT1 est entravée par l'absence d'inhibiteurs sélectifs de la protéase MALT1 présentant des propriétés pharmacologiques adaptées.

Modèle : souris homozygotes pour la mutation ^Malt1C472A, une mutation catalytiquement inactive insérée dans le site actif de la protéase, entraînant un knock-out avec perte d'activité protéasique.

Objectif : Étudier le rôle de l'activité protéasique de MALT1 dans les cellules immunitaires.

Résultats : L'activité protéasique de MALT1 s'est avérée essentielle au développement de populations de lymphocytes B de type inné. De plus, les réponses immunoglobulines induites par la vaccination avec des antigènes à la fois T-dépendants et T-indépendants dépendaient de l'activité protéasique de MALT1.

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Figure 1. Une mutation C472A dans le gène MALT1 inactive l'activité protéasique sans modifier l'expression de la protéine.

A) La recombinaison homologue du locus Malt1 de type sauvage (I) dans des cellules souches embryonnaires dérivées de la souche C57BL/6 a été utilisée pour introduire une mutation C472A, inactive sur le plan catalytique, dans l'exon 12 du gène Malt1.

Les souris issues de cette sélection et porteuses de la cassette Neo (II) ont été croisées avec une souche de souris « deleter » exprimant la recombinase FLP afin de générer des animaux porteurs de l’allèle inactif (III) utilisé dans ces études. Ces souris ont ensuite été croisées avec une souche « delete » exprimant la recombinase Cre afin de supprimer l’exon 12 et de générer un allèle nul (IV).

Triangles fermés : sites FRT; triangles ouverts : sites loxP.

B) Des lymphocytes B totaux purifiés provenant de la rate de souris de type sauvage (wt), ^Malt1-/– et ^Malt1C472A ont été traités avec (+) ou sans (-) PMA associé à de l'ionomycine pendant 1 heure, puis analysés par Western blot afin d'évaluer l'expression de MALT1, CYLD, Bcl10, ainsi que celle des formes clivées par protéolyse de CYLD et Bcl10.

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Figure 2. Le développement des populations de cellules B de la zone marginale (MZ) et de type B1 est considérablement altéré chez les souris ^Malt1PD/PD dont la protéase est inactivée.

Analyse représentative par cytométrie en flux des populations lymphocytaires chez des souris MALT1 wt, ^Malt1-/-, et ^Malt1PD/PD.

A, C) Population de lymphocytes B MZ (CD21-CD23+) dans la rate

B, D) Population de lymphocytes B1 (IgMhiCD5lo) dans le liquide péritonéal

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Figure 3. Réponses anticorps in vivo chez des souris de type sauvage (wt), ^Malt1-/– et ^Malt1PD/PD suite à une immunisation avec des antigènes dépendants et indépendants des lymphocytes T.

L'activité protéasique de MALT1 est nécessaire pour obtenir des réponses anticorps maximales, tant T-dépendantes que T-indépendantes, in vivo.

A) Lorsqueles souris wt, Malt1-/– et ^Malt1PD/PD ont été immunisées avec l'antigène T-dépendant KLH, les souris wt ont produit des titres élevés d'IgM anti-KLH du 7e au 28e jour, et le changement de classe d'Ig attendu s'est produit dès le 14e jour, la concentration en IgG anti-KLH augmentant jusqu'au 28e jour. Les souris ^Malt1PD/PD ont également présenté de faibles réponses en IgM et en IgG à l'immunisation par le KLH.

B) La vaccination de souris de type sauvage (wt), ^Malt1-/– et ^Malt1PD/PD avec l'antigène de type II TNP-Ficoll, indépendant des lymphocytes T, a donné lieu à un profil d'IgM similaire à celui observé lors de vaccinations dépendantes des lymphocytes T ; toutefois, la réponse en IgG des souris ^Malt1PD/PD n'a pas été significativement affectée. Ces résultats démontrent que l'activité protéasique de MALT1 contribue aux réponses anticorps dépendantes et indépendantes des lymphocytes T in vivo.

Cas n° 2) Perte de la capacité de liaison (médiée par SH2) : modèle de maladie humaine pour le syndrome de SHORT

Winnay JN, et al. Une mutation de la PI3-kinase associée à une résistance à l'insuline et aux facteurs de croissance in vivo. J Clin Invest. 2016.

Le syndrome SHORT est une maladie caractérisée par une petite taille, une lipodystrophie partielle et une résistance à l'insuline.

Une mutation hétérozygote du gène codant pour la sous-unité régulatrice p85α de la PI3K, ^{PI3KR1Arg649Tr,}a été identifiée chez des patients. Cette mutation se situe dans la région codant pour le domaine SH2 C-terminal de la p85α, qui est essentiel à la liaison de la PI3K aux protéines phosphorylées sur la tyrosine, et elle atténue considérablement l'activation insulino-dépendante de la voie PI3K.

Modèle : souris hétérozygotes pour la mutation ^p85R649W, homologue à la mutation observée chez la majorité des personnes atteintes du syndrome de SHORT.

Objectif : Évaluer si les mutations du gène PI3KR1 associées au syndrome de SHORT expliquent la physiopathologie à l'origine des anomalies observées chez les patients atteints du syndrome de SHORT.

Résultats : À l'instar des patients, les souris mutantes présentaient une diminution du poids et de la taille, une lipodystrophie partielle et une résistance systémique à l'insuline.

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Figure 1. Baisse du poids corporel et de la taille chez les souris ^p85WT/R649W.

A) Images représentatives de souris femelles ^p85αWT/WT (à gauche) et ^{p85αWT/R649W} (à droite) âgées de 24 semaines.

B) Poids corporel des souris ^p85αWT/WT (blanc) et ^{p85αWT/R649W} (rouge) mesuré au cours de la période indiquée. Les souris femelles sont représentées par des symboles triangulaires, et les souris mâles par des symboles circulaires.

C-E) Poids corporel à l'âge de 24 semaines, longueur corporelle et longueur du tibia chez des animaux mâles âgés de 12 semaines.

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Figure 2. Les souris mutantes hétérozygotes présentent une résistance à l'insuline.

A) Les souris Fed ^{p85αWT/R649W} présentaient une hyperglycémie marquée par rapport aux souris de type sauvage.

B) Les taux sériques d'insuline à jeun étaient nettement élevés chez les souris ^{p85αWT/R649W}.

C) Augmentation de la résistance à l'insuline, mesurée à l'aide de l'indice HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance), qui s'est révélée significativement plus élevée chez les souris mutantes.