Souris KI à mutation ponctuelle

Étude de cas

Modèle présentant des mutations ponctuelles hétérozygotes, parfaitement homologues à celles de la rétinite pigmentaire (RP) humaine.

‍SothilingamV, et al. Rétinite pigmentaire : impact de différentes mutations ponctuelles du gène Pde6a sur le phénotype de la maladie. Hum Mol Genet. 2015.

Les mutations du gène PDE6A peuvent entraîner une dégénérescence des photorécepteurs à bâtonnets et une rétinite pigmentaire, une maladie entraînant la cécité.

Modèle : nouveau modèle murin pour la mutation ponctuelle ^Pde6aR562W, associé à une lignée existante porteuse de la mutation ponctuelle V685M , afin de générer des animaux hétérozygotes composés ^{Pde6aV685M/R562W}, parfaitement homologues à un cas de RP humaine.

Objectif : Prédire l'évolution temporelle de la dégénérescence rétinienne liée au gène Pde6a et faciliter ainsi la définition d'une fenêtre thérapeutique pour les interventions cliniques.

Résultats : Cette étude fournit une base rationnelle permettant de formuler des prévisions concernant les phénotypes de la RP humaine et l'évolution de la maladie dans les cas d'hétérozygotie composée, et suggère de cibler les processus non apoptotiques comme approche thérapeutique envisageable.

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Figure 1. La perte d'expression de la PDE6A entraîne une accumulation de cGMP.

Une accumulation excessive de cGMP entraînant la mort des photorécepteurs à bâtonnets, suivie d'une mort secondaire des photorécepteurs à cônes, indépendante de toute mutation.

A, B) Dans la rétine de type sauvage (wt) de PN11 (A), l'immunomarquage de la PDE6A révèle une forte expression protéique dans les cellules OS des photorécepteurs.

En revanche, au même âge, dans la rétine hétérozygote composée V685M/R562W (C), la protéine est pratiquement absente.

C, D) Au stade PN11, la rétine de la souris sauvage ne présente pratiquement aucune immunoréactivité au cGMP (C).

Les mutants du gène PDE6A présentent toutefois des cellules photoréceptrices à bâtonnets individuelles dans lesquelles de grandes quantités de cGMP se sont accumulées (D).

E) La quantification des cellules positives au cGMP dans la couche des cellules neuronales externes (ONL) et l'intensité des pixels de la PDE6A dans la couche des cellules ganglionnaires (OS) (unités arbitraires ; AU) montrent une corrélation inverse. Les images sont représentatives de l'immunomarquage réalisé sur des coupes rétiniennes provenant d'au moins trois animaux indépendants pour chaque génotype.

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Figure 2. Mort et survie des cellules photoréceptrices.

A-C) Le test TUNEL réalisé sur la rétine de type sauvage a parfois mis en évidence des cellules en cours de mort cellulaire due à des processus de développement.

D-F) Chez les mutants Pde6a, la mort des cellules photoréceptrices a considérablement augmenté.

Les images montrent la situation aux temps P12, P15 et P21, qui correspondent au pic de mort cellulaire.

G, H) Le graphique linéaire en bas à gauche (G) illustre la progression de la mort des cellules photoréceptrices, mise en évidence par le test TUNEL, chez différents mutants de Pde6a. La courbe verte correspond au mutant V685M*R562W.

Les temps de pic ainsi que les amplitudes de pic correspondent à la vitesse de la dégénérescence rétinienne, illustrée par la perte de photorécepteurs (H).

Les images sont représentatives des tests TUNEL réalisés sur des coupes de rétine provenant d'au moins trois animaux distincts ; les quantifications présentées dans les figures G et H incluent les données issues de 3 à 7 animaux par génotype et par moment d'observation.

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Figure 3. La dégénérescence des photorécepteurs chez les mutants Pde6a est liée à l'activité de la calpaïne, et non à celle de la caspase.

L'activité de la calpaïne est souvent associée à des formes de mort cellulaire non apoptotiques, et chez tous les mutants Pde6a, elle présente une forte corrélation temporelle avec la progression de la mort des cellules photoréceptrices.

A) Quantification des cellules positives à la caspase-3, qui ne révèle qu'un nombre extrêmement faible de cellules aux pics respectifs de dégénérescence, sans différence significative (n.s.) par rapport au type sauvage (wt).

B) L'évolution de l'activité de la calpaïne a été analysée au fil du temps et a révélé une forte corrélation avec l'ampleur de la mort cellulaire et la progression de la dégénérescence rétinienne.